學(xué)習(xí)中心
根據(jù)抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色原理，組織切片或細胞標本中的抗原先和一抗結(jié)合，再利用一抗與標記生物素、熒光素等的二抗進行反應(yīng)，前者再用標記辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如鏈霉親和素等）結(jié)合，最后通過呈色反應(yīng)或熒光來顯示細胞或組織中化學(xué)成分，在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見細胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細胞爬片或組織切片上原位確定某些化學(xué)成分的分布和含量。
免疫組化實驗操作
1. 60℃烤片2小時
2. 脫蠟。二甲苯脫蠟15分鐘，三次
3. 水化。依次經(jīng)過無水乙醇、95%、90%、80%、70%，各5分鐘，蒸餾水（或自來水）5分鐘
4. PBS洗5分鐘，三次
5. 抗原修復(fù)。枸櫞酸緩沖液（約92-95℃）煮沸（沸水?。┬迯?fù)15分鐘，自然涼至室溫。PBS洗5分鐘，三次
6. 3%雙氧水封閉20分鐘，PBS洗5分鐘，三次
7. 正常山羊血清封閉，37℃20分鐘
8. 一抗孵育，4℃過夜.
9. 復(fù)溫20分鐘，PBS洗5分鐘，三次
10. 二抗孵育，37℃20分鐘（二抗為生物素標記的羊抗兔IgG），PBS洗5分鐘，三次
11. 三抗孵育，37℃20分鐘（三抗為辣根酶標記的鏈酶親和素），PBS洗5分鐘，三次
12. DAB顯色，鏡下觀察結(jié)果，適時終止
13. 蘇木素復(fù)染5分鐘，自來水沖洗片刻，75%的鹽酸酒精溶液分化30秒，自來水沖洗5分鐘藍化
14. 脫水。依次經(jīng)過70%、80%、90%、95%、無水乙醇，各5分鐘，二甲苯15分鐘，三次
15. 封片，中性樹膠封片
免疫組化樣本準備
組織切片或組織蠟塊
ELISA原理
ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法(圖a)、用于檢測抗原的雙抗體夾心法(圖b)以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。
ELISA實驗操作
取出試劑盒，于室溫（20-25℃）放置15-30分鐘。實驗過程應(yīng)在室溫（20-25℃）內(nèi)進行。
取出酶標板，按照標準品的次序分別加入100 μl的標準品溶液于空白微孔中。
空白微孔中加入100 μl的樣品，空白對照加入100μl的蒸餾水。
在各孔中加入50μl的酶標記溶液（不含空白對照孔）。
將酶標板用封口膠密封后，37℃孵育反應(yīng) 1小時（在孵育箱中保持穩(wěn)定的溫度與濕度）。
充分清洗酶標板5次，保持各孔有充足的水壓（濃縮洗滌液以1：100的比例與蒸餾水稀釋）。
酶標板洗滌后用吸水紙徹底拍干。
各孔加入顯色劑A 50 μl。
各孔加入顯色劑B 50 μl。
20-25℃下避光反應(yīng)10分鐘。
各孔加入50μl終止液，終止反應(yīng)。
ELISA樣本準備
在收集標本前都必須有一個完整的計劃，必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。我們提倡新鮮標本盡早檢測，對收集后當天就進行檢測的標本，及時儲存在4℃?zhèn)溆?，如有特殊原因需要周期收集標本，請造模取材后，將標本及時分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存。因冰室與室溫存在一定溫差，蛋白極易降解，直接影響實驗質(zhì)量，所以避免反復(fù)凍融。代測放免標本的客戶取材前須向我司銷售人員索要說明書，具體操作注意事項請與我司技術(shù)人員溝通。
◇液體類標本：
包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養(yǎng)上清等。
*血清：
室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
*血漿：
應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
*尿液：
用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實行。
*細胞培養(yǎng)上清：
檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
*組織標本：
切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
Western blot 原理
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達。
Western blot 操作步驟
組織裂解
(1)稱取100mg腦組織，剪碎后放入研缽中，然后加入液氮研碎組織，直至成粉末狀；
(2)加入1ml裂解液（裂解液中含有臨時加入的10μl蛋白酶抑制劑混合物），研磨，直至成為液體；
(3)轉(zhuǎn)至EP管，冰上靜置10min；
(4)4℃，12, 000r.p.m.，離心10min，取上清（胞漿蛋白）；
(5)－80℃，分裝凍存。
制備SDS-PAGE凝膠
(1)將灌膠玻璃板洗凈，晾干固定，確定灌制分離膠液面標志線（距樣品梳子底部約0.5-1.0cm處）。
(2)配制10%分離膠8ml（見下表），快速灌入凝膠玻璃槽中，使其液面至標志線位置（避免產(chǎn)生氣泡）。
(3)立即用去離子水覆蓋膠面（隔絕空氣，有助于凝膠聚合），室溫放置約40min至分離膠凝固。
(4)配制5%濃縮膠4ml（見下表）。
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10%分離膠 |
5%濃縮膠 |
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體積 |
8ml |
4ml |
4ml |
2ml |
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ddH2O |
3.2ml |
1.6ml |
2.72ml |
1.36ml |
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30%丙烯酰胺 |
2.67ml |
1.33ml |
0.66ml |
0.33ml |
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1.5MTris-cl (PH 8.8) |
2.0ml |
1.0ml |
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1.0MTris-cl (PH 6.8) |
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0.5ml |
0.25ml |
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10%SDS |
0.08ml |
0.04ml |
0.04ml |
0.02ml |
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10%AP |
0.08ml |
0.04ml |
0.04ml |
0.02ml |
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TEMED |
3.2μl |
1.6μl |
4μl |
2μl |
(5)倒掉去離子水覆蓋液，并用吸水紙吸掉殘留的液體。將凝膠板重新垂直放置，輕輕加入5%濃縮膠液（注意避免產(chǎn)生氣泡），插入樣品梳，室溫凝膠約40分鐘。
(6)輕輕拔去梳子，將玻璃夾板“凹”面貼緊電泳槽，兩側(cè)用夾子很好的固定在電泳槽上。
樣品變性及電泳
(1)由-80℃冰箱取出提取的組織總蛋白樣品，立即插入冰中（減少蛋白降解）待其融化。
(2)根據(jù)蛋白定量結(jié)果，加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品與5×蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液,輕輕混合，95℃變性10分鐘，立即插入冰中待用。
(3)將樣品輕輕加至凝膠孔中，電泳儀設(shè)置成穩(wěn)壓狀態(tài)，接通電源，將電壓調(diào)至80V使樣品通過濃縮膠與分離膠（電壓約8v/cm）。電泳使染料至分離膠適當位置，結(jié)束電泳。
3.4 凝膠轉(zhuǎn)膜及其檢測
凝膠電泳結(jié)束后，將凝膠上分離到的蛋白條帶通過轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至固相支持物上，然后分別用非標記一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗對其進行孵育、檢測。用于Western印跡法的固相支持物有多種，本實驗采用PVDF膜作為固相支持物。本實驗采用濕轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)膜方式。
(1) PVDF膜的預(yù)處理：先置于100%甲醇中浸泡2-3min，水、電轉(zhuǎn)液依次漂洗2min×2次，置于電轉(zhuǎn)液中備用；
(2)剪裁與膠同樣大小的6層濾紙，用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡后待用。
(3)取下電泳板，將其平置（使“凹”面玻璃板在下），小心取出夾板中的墊片及去掉上層玻璃板，切除多余凝膠，將含樣品膠用電轉(zhuǎn)液漂洗一次。
(4)將樣品膠與膜裝入標有正、負極的轉(zhuǎn)膜夾板中：由陰極側(cè)開始，依次為海綿墊片→3層濾紙→樣品膠→PVDF膜→三層濾紙（注意：排除氣泡）→海綿墊片，扣緊轉(zhuǎn)膜夾板，放入含有轉(zhuǎn)膜緩沖液的轉(zhuǎn)移電泳槽中。
(5)正確連接轉(zhuǎn)移電泳連線，保證電荷由負極向正極流動。接通電源，恒壓狀態(tài)下，65v轉(zhuǎn)膜2h（此步操作宜在4℃冰箱中進行）。
(6)封閉：小心取出轉(zhuǎn)移膜置于封閉液中，室溫、搖床上緩慢搖動狀態(tài)下封閉1h。
(7)一抗反應(yīng)：將一抗用封閉液稀釋1000倍；將封閉后的膜直接放入一抗工作液中，4℃反應(yīng)過夜。
(8)洗膜：將反應(yīng)膜放入平皿中，用1×TBST洗滌三次，（室溫下緩慢搖動洗滌）每次10分鐘，洗凈未結(jié)合的一抗。
(9)二抗反應(yīng)：將二抗用1×TBST稀釋3000倍；將洗滌后的一抗反應(yīng)膜放入二抗工作液中（室溫、避光緩慢搖動）作用60分鐘。
(10)洗膜：用1×TBST洗膜，方法同(8)，洗去游離二抗。
(11)曝光及洗片：
①按1：1（v/v）混合ECL試劑盒中兩種液體。
②將上述混合液均勻鋪在PVDF膜表面，室溫作用4分鐘。抖掉膜上液體，將其放入鋪有保鮮膜的曝光盒中，再將保鮮膜折疊，以包裹住PVDF膜。
Western blot 樣本準備
應(yīng)是新鮮的組織細胞樣品，需低溫保存提供到我公司
實驗所用試劑；除第一抗體外，所有試劑免費，用戶無須另行購買
