免疫組化操作步驟
第一節(jié) 免疫組化操作步驟及抗原修復(fù)（供參考）
第二節(jié) 免疫組化抗原熱修復(fù)的技術(shù)要點(diǎn)（供參考）
?。ㄒ唬?、儀器設(shè)備
1. 18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐.
2. 水浴鍋
（二）、試 劑
1. PBS緩沖液（pH7.2―7.4）
2．0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液（CB,pH6.0,1000ml）
3. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制
4. 風(fēng)裱劑：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制
5．TBS/PBS pH9.0–9.5,適用于熒光纖維鏡標(biāo)本;pH7.0-7.4適合光學(xué)纖維標(biāo)本
?。ㄈ?、操作流程
1、脫蠟和水化：脫蠟前應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。
a 組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后在浸泡10分鐘
b 無水乙醇中浸泡五分鐘
c 95%乙醇中浸泡五分鐘
d 75%乙醇中浸泡五分鐘
2、抗原修復(fù)：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片：
抗 原 修 復(fù)（免疫組化石蠟切片）
用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片需要抗原修復(fù)
福爾馬林固定的組織有可能破壞了原來組織的抗原結(jié)構(gòu)，蛋白多肽發(fā)生交聯(lián)，導(dǎo)致部分抗原表位封閉，結(jié)合位點(diǎn)減少，所以需要抗原修復(fù)，以暴露原來的抗原表位，達(dá)到充分顯露抗原，以不出現(xiàn)明顯脫片現(xiàn)象為佳。
抗原修復(fù)的幾種常用方法（供參考）
1. 微波爐加熱：在微波爐里加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5-10分鐘，反復(fù)1-2次。根據(jù)玻片情況可參考采用微波加熱“3-5-3法”3分鐘溫火沸騰后靜止5分鐘，再溫火沸騰3分鐘即可。
適用的抗原：來源于人、大鼠、小鼠的組織標(biāo)本；來源于其他動(dòng)物種屬的組織標(biāo)本：
2. 沸熱修復(fù)： 電爐或水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10-15分鐘。
3. 高壓熱修復(fù)：在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）.蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡五分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會(huì)升起來。10分鐘后除去熱源，置入涼水中，當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復(fù)。（骨及軟骨組織的標(biāo)本最好選擇較溫和的微波加熱修復(fù)）
4. 酶消化方法：
常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱37℃，消化時(shí)間約為5-30分鐘。適用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等
石蠟切片免疫組化染色步驟
1.三步法（以SP試劑盒為例）
●石蠟切片脫蠟至水。
●蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，如果采用抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行。
●3%H2O2室溫孵育5~10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗，2分鐘×3次。
●5~10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小時(shí)或4℃過夜。
●PBS沖洗，2分鐘×3次。
●滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗（1%BSA-PBS稀釋），37℃孵育10~30分鐘；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘。
●PBS沖洗，2分鐘×3次。
●滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育10~30分鐘；或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘。
●PBS沖洗，2分鐘×3次。
●顯色劑顯色（DAB或AEC）。
●自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水透明、封片。
●如果必要，可選用avdin封閉內(nèi)源性生物素。
2.SABC法
（1） 脫蠟、水化
（2）PBS洗2次各5分鐘
（3）用蒸餾水或PBS配制新鮮的3%H2O2，室溫封閉5-10分鐘，用蒸餾水洗3次
（4）抗原修復(fù)
（5） PBS洗5分鐘
（6）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體
（7）滴加Ι抗50ul,室溫靜置1小時(shí)或4℃過夜或37℃1小時(shí)
（8）PBS洗3次各2分鐘
（9）滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分鐘
（10）PBS洗3次各2分鐘
（11）滴加試劑SABC 20℃-30℃ 20分鐘
（12） PBS洗4次各5分鐘
（13） DAB顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色
（14）脫水、透明、封片、鏡檢。
冰凍切片的免疫組化染色步驟
●速凍組織
●冰凍切片4~8μm，冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲(chǔ)存低溫冰箱內(nèi)，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后儲(chǔ)存于-20℃冰箱。
●室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘。也可根據(jù)需要選擇其他的固定方式。
●PBS沖洗，5分鐘×3次。
●用3%過氧化氫孵育5~10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。
●PBS沖洗，5分鐘×3次。
●下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟（滴加一抗開始）。
第二節(jié) 免疫組化抗原熱修復(fù)的技術(shù)要點(diǎn)（供參考）
1、 抗原熱修復(fù)溫度和時(shí)間的關(guān)系
我們?nèi)粘９ぷ髦兴褂玫慕M織固定液福爾馬林會(huì)引起組織蛋白內(nèi)或蛋白之間的亞甲基發(fā)生橋連，具體過程如下：
第一步基本反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的化合物
第二步基本反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的亞甲基橋
上述反應(yīng)的結(jié)果導(dǎo)致許多抗原決定簇被封閉，而加熱可以水解該橋連使抗原被激活。影響抗原熱修復(fù)的兩個(gè)最關(guān)鍵的因素是溫度和時(shí)間，有人將這兩種因素對抗原修復(fù)的影響總結(jié)為下面的公式：
抗原熱修復(fù)的有效性=加熱溫度（T） × 加熱時(shí)間（t）
也就是說當(dāng)我們修復(fù)時(shí)的溫度越低則需要修復(fù)的時(shí)間就越長；反過來當(dāng)修復(fù)溫度增高時(shí)修復(fù)的時(shí)間可以適當(dāng)?shù)乜s短，才能使抗原決定簇完全暴露，這種反比的關(guān)系從MBI單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1中也可以清楚地看出。
時(shí)間和溫度對染色的影響
時(shí)間（分鐘）
100℃ 80℃ 60℃
5×2 + + + ― ―
5×6 + + + + + + + ―
5×10 ― + + + + +
10小時(shí) ― ― + +
如果修復(fù)強(qiáng)度不夠，免疫組織化學(xué)染色所顯示的只能是修復(fù)后暴露的部分抗原決定簇，而不是組織所含的全部抗原。這樣的染色結(jié)果可能會(huì)非常弱，或出現(xiàn)假陰性，即使是陽性結(jié)果，充其量只能起到定性的作用，不能適應(yīng)今后對免疫組化進(jìn)行定量的需要。這就給我們診斷中定量指標(biāo)的應(yīng)用帶來困難，例如用來測定耐藥的指標(biāo)。
2、組織固定時(shí)間和所需的抗原熱修復(fù)的關(guān)系
大量的實(shí)驗(yàn)表明，固定時(shí)間越長的標(biāo)本，它所形成的橋連就越緊密，抗原就越難以被激活，所需要的修復(fù)強(qiáng)度也就越強(qiáng)。有意思的是隨著固定時(shí)間的延長，組織中蛋白對溫度的耐受也相應(yīng)增高（如圖1所示），這可能就是我們對固定時(shí)間長的標(biāo)本加大修復(fù)強(qiáng)度的理論基礎(chǔ)。
固定時(shí)間和變性的關(guān)系
這就提醒我們在做回顧性的研究時(shí)一定要注意所使用的修復(fù)條件，它與新鮮標(biāo)本的修復(fù)條件一定是有所區(qū)別的，同等條件下一定要加長修復(fù)的時(shí)間或提高修復(fù)所使用的溫度，才可能得到比較滿意的結(jié)果。
3、 不同PH值抗原修復(fù)液對染色結(jié)果的影響
抗原熱修復(fù)中所使用的修復(fù)液PH值也會(huì)對染色結(jié)果產(chǎn)生相當(dāng)大的影響。PH值對染色結(jié)果的影響大概可以分為以下四種情況。
A―穩(wěn)定型，PH值對染色結(jié)果影響不大，如PCNA、AE1、EMA、CD20等。
B―V型，高PH值和低PH值染色較好，而PH值4-5染色結(jié)果較差，如ER、Ki-67等。
C―上升型，隨著PH值的增加，染色結(jié)果逐漸增強(qiáng)，如HMB45等。
D―下降型，隨著PH值的增加染色結(jié)果逐漸減弱，當(dāng)然這種類型的抗體只是個(gè)別的現(xiàn)象，如MOC31。
一個(gè)有趣的現(xiàn)象值得注意，即在高PH值都有較好的染色結(jié)果，所以目前比較推崇的抗原修復(fù)液為高PH值得修復(fù)液，如1mMEDTA, PH8.0或PH9.0等。但是由于傳統(tǒng)習(xí)慣，絕大多數(shù)醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室都在使用PH6.0的枸櫞酸緩沖液。綜合以上各種抗體的染色狀況，考慮到臨床工作的實(shí)際情況，許多國外免疫組化專家建議，在常規(guī)的免疫組化工作中，全部選用高PH值得修復(fù)液來代替目前廣為使用的PH6.0枸櫞酸緩沖液。為此，本公司已經(jīng)推出PH8.0和PH9.0的新型抗原修復(fù)液。經(jīng)驗(yàn)證，絕大多數(shù)的抗體使用PH9.0得修復(fù)液效果都要優(yōu)于PH6.0的枸櫞酸，尤其是核陽性的抗體。所以，在常規(guī)的免疫組化工作中，使用高PH值的抗原修復(fù)液是今后的必然趨勢。
4、抗原熱修復(fù)的手段
微波爐修復(fù)和高壓鍋修復(fù)的比較
溫度 壓力 v時(shí)間 受熱
微波爐 100℃ 1P 15~20分鐘 不均勻
高壓鍋 120℃ 1.2P 噴氣2分鐘 均勻
目前抗原熱修復(fù)所采用的方法主要有微波爐修復(fù)和高壓鍋修復(fù)兩種，從表中可以看出，由于高壓鍋修復(fù)具有溫度均一、節(jié)省時(shí)間、效果穩(wěn)定等特點(diǎn)，已經(jīng)越來越受到人們的青睞。
免疫組化問題解答
1、染色過強(qiáng)
原因 解決方法
a 抗體濃度過高或孵育時(shí)間過長 降低抗體滴度、抗體孵育時(shí)間：室溫1小時(shí)或4度過夜
b 孵育溫度過高超過37度 一般在室溫20-28度
c DAB顯色時(shí)間過長或濃度過高 顯色時(shí)間不超過5-12分鐘，以顯微鏡下觀察為準(zhǔn)
2、非特異性背景染色
原因 解決方法
a 操作過程中沖洗不充分 每步?jīng)_洗3次每次5分鐘
b 組織中含過氧化物酶未阻斷 可再配置新鮮3%H2O2封閉孵育時(shí)間延長
c 組織中含內(nèi)原性生物素 正常非免疫動(dòng)物血清再封閉
d 血清蛋白封閉不充分 延長血清蛋白封閉時(shí)間
3、染色弱
原因 解決方法
a 抗體濃度過低、孵育時(shí)間過短 提高抗體濃度、孵育時(shí)間不能少 于60分鐘
b 試劑超過有效使用時(shí)間 應(yīng)更換試劑
c 操作中添加試劑時(shí)緩沖液未瀝干 每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液
使試劑稀釋 （應(yīng)防止切片干燥）
d 室溫太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分鐘或4 度冰箱過夜
e 蛋白封閉過度 封閉不要超過12分鐘
4、染色陰性
原因 解決方法
a 操作步驟錯(cuò)誤 應(yīng)重試 設(shè)陽性對照
b 組織中無抗原 設(shè)陽性對照以驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果
c 一抗與二抗種屬連接錯(cuò)誤 仔細(xì)確定一抗二抗種屬無誤
速凍組織
●將組織塊平放于軟塑料蓋或特制小盒內(nèi)（直徑2cm），如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)，當(dāng)盒底部接觸液氮時(shí)即開始?xì)饣序v，此時(shí)小盒保持原位切勿浸入液氮內(nèi)，大約10-20秒組織即迅速冰凍成塊。取出組織冰塊立即置入-80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?，或置于恒冷切片機(jī)冰凍切片。
● 冰凍切片4～8mm，冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲(chǔ)存低溫冰箱內(nèi)，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后儲(chǔ)存冰箱內(nèi)保存。
●室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘。也可根據(jù)需要選擇其它的固定方式。
●PBS洗，5分鐘×3。
● 用3%過氧化氫孵育5~10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。
●PBS洗，5分鐘×3。
●下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟（滴加一抗開始）。
影響抗原熱修復(fù)的關(guān)鍵因素
目前免疫組織化學(xué)染色技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到各級醫(yī)院臨床病理診斷中，但是由于實(shí)驗(yàn)條件的差別和傳統(tǒng)觀念的影響，使得免疫組化染色結(jié)果差別很大，從而影響到病理診斷這個(gè)“金標(biāo)準(zhǔn)”的含金量，給醫(yī)院和病人帶來一些不必要的損失。所以，提高免疫組織化學(xué)染色技術(shù)水平的需要變得越來越迫切。眾所周知，免疫組織化學(xué)染色中最關(guān)鍵的步驟莫過于抗原的修復(fù)了，而絕大多數(shù)常用抗體的修復(fù)是通過加熱來完成的，可以這樣說，抗原熱修復(fù)是免疫組化的關(guān)鍵技術(shù)，會(huì)直接影響到最終的染色結(jié)果。
1、抗原熱修復(fù)溫度和時(shí)間的關(guān)系
我們?nèi)粘９ぷ髦兴褂玫慕M織固定液福爾馬林會(huì)引起組織蛋白內(nèi)或蛋白之間的亞甲基發(fā)生橋連，具體過程如示：上述反應(yīng)的結(jié)果導(dǎo)致許多抗原決定簇被封閉，而加熱可以水解該橋連使抗原被激活。影響抗原熱修復(fù)的兩個(gè)最關(guān)鍵的因素是溫度和時(shí)間，有人將這兩種因素對抗原修復(fù)的影響總結(jié)為下面的公式：
抗原熱修復(fù)的有效性=加熱溫度（T）×加熱時(shí)間（t）
也就是說當(dāng)我們修復(fù)時(shí)的溫度越低則需要修復(fù)的時(shí)間就會(huì)越長；反過來當(dāng)修復(fù)溫度增高時(shí)則修復(fù)的時(shí)間可以適當(dāng)?shù)乜s短，才能使抗原決定簇完全暴露，這種反比的關(guān)系從MBI單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表一中也可以清楚地看出。如果修復(fù)強(qiáng)度不夠，免疫組織化學(xué)染色所顯示的只能是修復(fù)后暴露出的部分抗原決定簇，而不是組織所含的全部抗原。這樣的染色結(jié)果可能會(huì)非常弱，或出現(xiàn)假陰性，即使是陽性結(jié)果，充其量只能起到定性的作用，不能適應(yīng)今后對免疫組化進(jìn)行定量的需要。這就給我們診斷中定量指標(biāo)的應(yīng)用帶來困難，例如用來測定耐藥的指標(biāo)。
2、組織固定時(shí)間和所需的抗原熱修復(fù)的關(guān)系
大量的實(shí)驗(yàn)表明，固定時(shí)間越長的標(biāo)本，它所形成的橋連就越緊密，抗原就越難以被激活，所需要的修復(fù)強(qiáng)度也就越強(qiáng)。有意思的是隨著固定時(shí)間的延長，組織中蛋白對溫度的耐受也會(huì)相應(yīng)增高，這可能就是我們對固定時(shí)間長的標(biāo)本加大修復(fù)強(qiáng)度的理論基礎(chǔ)。這就提醒我們在做回顧性研究時(shí)一定要注意所使用的修復(fù)條件，它與新鮮標(biāo)本的修復(fù)條件一定是有所區(qū)別的，同等條件下一定要加長修復(fù)的時(shí)間或提高修復(fù)所使用的溫度，才可能得到比較滿意的結(jié)果。
3、不同pH值抗原修復(fù)液對染色結(jié)果的影響
抗原熱修復(fù)中所使用的修復(fù)液pH值也會(huì)對染色結(jié)果產(chǎn)生相當(dāng)大的影響。pH值對染色結(jié)果的影響大概可以分為以下四種情況。
A — 穩(wěn)定型，pH值對染色結(jié)果的影響不大，如PCNA、AE1、EMA、CD20等。
B — V型，高pH值和低pH值染色較好，而pH值4-6染色結(jié)果較差，如ER、Ki-67等。
C — 上升型，隨著pH值的增加，染色結(jié)果逐漸增強(qiáng)，如HMB45等。
D — 下降型，隨著pH值的增加，染色結(jié)果逐漸減弱，當(dāng)然這種類型的抗體只是個(gè)別的現(xiàn)象，如MOC31?！ ∫粋€(gè)有趣的現(xiàn)象值得注意，即在高pH值（約pH8.0~9.0），A、B、C三者都有較好的染色結(jié)果，所以目前比較推崇的抗原修復(fù)液為高pH值的修復(fù)液，如1mM EDTA, pH8.0或pH9.0等。但是由于傳統(tǒng)習(xí)慣，絕大多數(shù)醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室都在使用pH6.0的枸櫞酸緩沖液。綜合以上各種抗體的染色狀況，考慮到臨床工作的實(shí)際情況，許多國外免疫組化專家建議，在常規(guī)的免疫組化工作中，全部選用高pH值的修復(fù)液來代替目前廣為使用的pH6.0枸櫞酸緩沖液。為此，本公司已經(jīng)推出pH8.0和pH9.0的新型抗原修復(fù)液。經(jīng)驗(yàn)證，絕大多數(shù)的抗體使用pH9.0的修復(fù)液效果都要優(yōu)于pH6.0的枸櫞酸，尤其是核陽性的抗體。所以，在常規(guī)的免疫組化工作中，使用高pH值的抗原修復(fù)液是今后的必然趨勢。
4、抗原熱修復(fù)的手段
目前抗原熱修復(fù)所采用的方法主要有微波爐修復(fù)和高壓鍋修復(fù)兩種，從表二中可以看出，由于高壓修復(fù)具有溫度均一、節(jié)省時(shí)間、效果穩(wěn)定等特點(diǎn)，已經(jīng)越來越受到人們的青睞。
5、抗原熱修復(fù)具體操作過程
可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件，選用微波爐抗原修復(fù)、高壓鍋抗原修復(fù)或水浴高溫抗原修復(fù)。抗原熱修復(fù)可選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實(shí)驗(yàn)證明，以1mM的EDTA抗原修復(fù)液（pH8.0或pH9.0）效果最好。
5.1 石蠟切片微波爐抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水后，蒸餾水沖洗2分鐘×3。將切片放入盛有抗原修復(fù)液（工作液）的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在96℃~98℃之間并持續(xù)15~20分鐘（注意：無論是使用醫(yī)用或家用微波爐，請根據(jù)具體機(jī)型酌情設(shè)置條件，務(wù)必滿足以上步驟中對溫度和時(shí)間的要求）。取出容器，室溫冷卻20~30分鐘（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，避免蛋白恢復(fù)至原有的空間構(gòu)型）。PBS洗，3%H2O2處理10分鐘，下接免疫組化染色步驟。
5.2 石蠟切片高壓抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水。將適量的抗原修復(fù)液（工作液）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內(nèi)，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當(dāng)壓力鍋開始慢慢噴氣時(shí)（約加熱5~6分鐘后），計(jì)時(shí)1.5~2.5分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，室溫冷卻15分鐘，取下氣閥，打開鍋蓋，切片冷卻至室溫后，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘×3，3%H2O2處理10分鐘，下接免疫組化染色步驟。
5.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修復(fù)操作方法：切片脫蠟至水后，放入盛有抗原修復(fù)液（工作液）的容器中，并將此容器置于盛有一定數(shù)量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達(dá)92℃~98℃起開始計(jì)時(shí)15~20分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻20~30分鐘，蒸餾水沖洗，PBS洗，下接免疫組化染色步驟。
