學(xué)習(xí)中心
上海藍基生物科技有限公司是專業(yè)化的抗體試劑開發(fā)、生產(chǎn)公司，有著一整套完整、規(guī)范的蛋白檢測及鑒定技術(shù)。為了適應(yīng)廣大生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域科研人員及學(xué)者對Western Blotting 實驗日益增長的需求，為從事生命科學(xué)研究的學(xué)者提供快捷方便的服務(wù)，本公司實驗室將提供Western Blotting的對外技術(shù)服務(wù)。
1. Western Blotting ：每張膜可做1-8個樣品 ；收費標(biāo)準(zhǔn)：1600.00元/每膜
2. 檢測方法：NBT或ECL化學(xué)發(fā)光檢測法；預(yù)計完成時間：2周工作日
3. 對預(yù)做實驗提供的樣品要求：應(yīng)是新鮮的組織細胞樣品，需低溫保存提供到我公司
4. 實驗所用試劑；除第一抗體外，所有試劑免費，用戶無須另行購買
5. 因用戶所提供的樣品或試劑所導(dǎo)致的實驗問題，由用戶負(fù)責(zé)
6. 最后提供檢測結(jié)果： 根據(jù)客戶要求提供曝光X膠片或NBT染色的NC膜或掃描圖片
細胞和組織的蛋白提取
培養(yǎng)細胞
取出裂解液，待融化后，顛倒混勻數(shù)次，適量分裝凍存。在使用前取出，按比例加入PMSF（使其最終濃度為1mM），混勻，立即使用。
（1）貼壁細胞，去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗2-3遍（如血清中的蛋白沒有干擾，也可以不洗）。按6孔板每孔加入100-200微升的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸細胞數(shù)秒后細胞就會被裂解。
（2）懸浮細胞，收集培養(yǎng)細胞，離心去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗2-3遍（如血清中的蛋白沒有干擾，也可以不洗），用手指把細胞用力彈散，按6孔板每孔細胞加入100-200微升的比例加入裂解液。如果細胞數(shù)量較大，應(yīng)按50-100萬細胞/管分裝或根據(jù)細胞數(shù)量按比例增加裂解液。用手指輕彈管底以促進裂解液和細胞充分接觸，裂解完全時應(yīng)無明顯的細胞顆粒。
裂解物經(jīng)10000-12000離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的western實驗。
裂解液用量說明：通常6孔板細胞加入100微升裂解液已經(jīng)足夠，但如果細胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到150微升或200微升。
2．組織樣品
取EP管，分別稱重標(biāo)記，把組織剪切成小塊裝入EP管中，稱重。按每20毫克組織加200-400微升的比例加入裂解液（如裂解不完全，可以適當(dāng)增加裂解液的用量；如需要的蛋白樣品濃度較高，可以適當(dāng)減少裂解液的用量）。用手握式電動組織細胞勻漿器勻漿約1分鐘或直至充分裂解。12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清，即可進行后學(xué)的western操作。
BCA測蛋白方法
蛋白質(zhì)定量是蛋白質(zhì)研究的基礎(chǔ)工作之一,BCA蛋白質(zhì)檢測試劑(bicinchoninic acid)是理想的蛋白質(zhì)定量方法;是當(dāng)前比Lowry法更優(yōu)越的專用于檢測總蛋白質(zhì)含量的產(chǎn)品。該方法以快速靈敏、穩(wěn)定可靠，對不同種類蛋白質(zhì)檢測的變異系數(shù)非常小而倍受專業(yè)人士的青睞。BCA法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響。在組織細胞裂解實驗中，常用濃度的去垢劑SDS，Triton X-100，Tween不影響檢測結(jié)果，但受螯合劑(EDTA，EGTA)、還原劑（DTT，巰基乙醇）和脂類的影響。實驗中，若發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身背景值較高，可試用Bradford蛋白濃度測定試劑盒。該產(chǎn)品不受此影響，因此與之配合使用，可免除您實驗中的許多煩惱。
基本原理
堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+， Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。
主要特點
1.準(zhǔn)確靈敏,線性范圍廣: BCA試劑的蛋白質(zhì)測定范圍是10－2000ug/ml；
2.快速：45分鐘內(nèi)完成測定，比經(jīng)典的Lowry法快4倍而且更加方便。
3.經(jīng)濟實用：在微孔板中進行測定，可大大節(jié)約樣品和試劑用量。
4.不受樣品中離子型和非離子型去污劑影響。
5.檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠小于考馬氏亮藍。
包裝及保存
BCA試劑 A 70ml室溫保存
BCA試劑 B1.4ml室溫保存
蛋白標(biāo)準(zhǔn) 0.5ml
注意事項
1.在低溫條件或長期保存出現(xiàn)沉淀時，可攪拌或37℃溫育使溶解,如發(fā)現(xiàn)細菌污染則應(yīng)丟棄
2.樣品中若含有EDTA、EGTA、DTT、硫酸銨、脂類會影響檢測結(jié)果，請試用Bradford蛋白濃度測定試劑盒；高濃度的去垢劑也影響實驗結(jié)果，可用TCA沉淀去除干擾物質(zhì)。
3.要得到更為精確的蛋白濃度結(jié)果，每個蛋白梯度和樣品均需做復(fù)孔,每次均應(yīng)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4.當(dāng)試劑A和B混合時可能會有渾濁，但混勻后就會消失，工作液在密閉情況下可保存1周。
5.需準(zhǔn)備37℃水浴或溫箱、酶標(biāo)儀或普通分光光度計，測定波長為540-595nm之間，562nm最佳。酶標(biāo)儀需與96孔酶標(biāo)板配套使用。使用分光光度計測定蛋白濃度時，試劑盒測定的樣品數(shù)量會因此而減 少。使用溫箱孵育時，應(yīng)注意防止因水粉蒸發(fā)影響檢測結(jié)果。
使用說明
1.配制工作液:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50:1）配制適量BCA工作液，充分混勻。BCA工作液室溫24小時內(nèi)穩(wěn)定。
2.稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：取10微升標(biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋至100微升（標(biāo)準(zhǔn)品一般可用PBS稀釋），使終濃度為0.5mg/ml。將標(biāo)準(zhǔn)品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20微升加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加PBS補足到20微升。
3.加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中，補加PBS到20微升。
4.各孔加入200微升BCA工作液，37℃放置30分鐘。
5.冷卻到室溫，用酶標(biāo)儀測定A562，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白濃度。
在western實驗中，通常有人采用TBS，有人采用PBS，能否有人解釋一下二者在使用中的區(qū)別？
選擇合適的緩沖液對于維持一定PH值下蛋白質(zhì)的穩(wěn)定及保證實驗的重復(fù)性是很重要的。PBS的緩沖能力強于TBS（因為混合緩沖液在一定的離子強度下常常具有更寬的緩沖范圍），TBS在PH7.0以下緩沖能力較弱（不過PBS易污染）。但我們常常要根據(jù)我們實驗?zāi)康倪x用合適的緩沖液，如在蛋白純化中進行陰離子交換層析，陽離子緩沖液首選TBS；陽離子交換層析時，陰離子緩沖液則首選PBS。
western blot中使用TBS和PBS均可，只是要根據(jù)需要選擇合適的濃度。
2.沒有注明可以用來做western blot的一抗，可以用來做western blot嗎？
不一定,因為有的抗體是識別線性表位的,有的是識別構(gòu)象型表位的，識別構(gòu)象型表位的抗體不能用于western blotting，因為在western blotting中抗體識別的是完全變性的蛋白質(zhì)抗原，而蛋白質(zhì)抗原的構(gòu)象型表位變性時被破壞。
3.做western每次只加一種一抗，請教有人同時加兩種或者多種一抗的嗎？
最好還是不要同時加兩種一抗。因為如果結(jié)果里面有非特異信號的話，就說不清楚了。做Western在同一張膜上檢測目的蛋白和內(nèi)對照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片；漂洗以后，再上內(nèi)對照的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片。
4.western blot使用的膜哪種最好啊，PVDF好還是NC膜，能介紹一下膜的選擇嗎？
PVDF膜價格較貴，可重復(fù)使用，特別適合蛋白印跡，結(jié)合能力較強，但價格比較昂貴。NC膜價格比較便宜，應(yīng)用較廣，結(jié)合牢固性差一些，韌性也不如PVDF，不能重復(fù)使用，但蛋白吸附容量高，親水性較好。 都可以用麗春紅染色。具體使用還要參考相關(guān)文獻。
5.為什么出現(xiàn)了多條帶,每個加樣槽中都出現(xiàn)了多條帶，而且好象都很有規(guī)律,為什么?是封閉時間不夠嗎,請指教 .做WESTERN必須要內(nèi)參嗎？
一抗、或二抗抗體濃度太高，多克隆抗體本身的非特異性反應(yīng)，抗體的特異性不強，目的蛋白經(jīng)過處理后發(fā)生變化,而內(nèi)參的條帶基本均勻一致.這樣才有說服力,表明的確是處理因素造成目的蛋白的變化而不是加樣誤差或認(rèn)為的造成目的條帶濃度的變化.所以嚴(yán)格意義上說,內(nèi)參是必須做的。
6.western用的一抗,單抗好些還是用多抗好些？購買一抗時發(fā)現(xiàn)單抗（用于western)比多抗（用于western和ELISA)要便宜不少,用于western的抗體和用于ELISA的抗體有什么不同的要求？
作為western來講，理論上單抗比多抗的特異性要好，但單抗種類較少一般價格偏高，所以一般來說多抗足夠了。用于western的抗體和用于ELISA的抗體，一般來說用于western的抗體識別的是氨基酸序列特異性；而可用于ELISA的抗體則要看抗原種類，有些是識別氨基酸序列特異性，有些是識別構(gòu)像特異性。所以一般根據(jù)抗體說明書來確定。
做免疫印跡時選擇抗體主要應(yīng)考慮兩個問題，一是所選抗體是否能識別凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至膜上的變性蛋白，另一個是所選抗體是否會引起交叉反應(yīng)條帶。
7.半干轉(zhuǎn)是否要求膜，濾紙，膠同樣大?。恳驗槟z大小不一定規(guī)則，膜和濾紙會大一點，那樣會不會短路？什么是短路？如何控制和發(fā)現(xiàn)短路呢？
可以相等，但是如果紙、膜比凝膠大就比較容易形成短路了，上下兩層慮紙也不能因過大而相互接觸，這樣同樣會短路，電流不會通過膠和慮紙。轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移過程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的， 最后結(jié)束時一般是開始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和濾紙選的對就不會短路。
8.Western Blot哪種染色好？
（1）陰離子染料是較常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測極限可達到1.5μg，考馬斯亮藍雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測后容易從蛋白質(zhì)中除去 ，以便進行隨后的氨基酸分析。缺點是：溶劑系統(tǒng)的甲醇會引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用語正電賀的膜。靈敏度低。
（2）膠體金，靈敏度高，檢測范圍可到pg級，但染色比穩(wěn)定。
（3）生物素化靈敏度位于1、2之間，可用于任何一種膜。
9.不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上， 轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？
可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度）(優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩沖液，可以參考《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》)，因為甲醇可降低蛋白質(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯(lián)；低濃度膠，如低至6％。太大時還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉(zhuǎn)移電壓／電流；增加轉(zhuǎn)移時間。
10.DAB顯色、堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色原理是什么？
DAB顯色在辣根過氧化酶的作用能形成一種灰褐色的終末產(chǎn)物，該產(chǎn)物難溶于醇和其他有機溶劑，DAB的氧化還能引起聚合作用，導(dǎo)致與四氧化鋨反應(yīng)而增加其染色強度和電子密度。堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色中，酶將奈酚磷酸（底物）水解成酚類和磷酸。酚和無色的重氮鹽（顯色原）結(jié)合而產(chǎn)生有色的、不溶性偶氮染料。
11.酶顯色與熒光顯色之間，各自的優(yōu)缺點是什么？
免疫酶技術(shù)就是用酶(如辣根過氧化物酶)標(biāo)記已知抗體(或抗原)，然后與組織標(biāo)本在一定條件下反應(yīng)，如果組織中含有相應(yīng)抗原(或抗體)，抗原抗體相互結(jié)合形成的復(fù)合物中所帶酶分子遇到底物時，能催化底物水解、氧化或還原，產(chǎn)生顯色反應(yīng)，這樣就可以識別出標(biāo)本抗原(抗體)分布的位置和性質(zhì)，通過圖像分析并可達到定量的目的。
免疫熒光技術(shù)雖已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)的研究與診斷，但是熒光抗體染色標(biāo)本不能長期保存，對組織細胞的細微結(jié)構(gòu)分辨不清，免疫酶技術(shù)則能克服上述不足，標(biāo)記免疫酶技術(shù)的敏感性更優(yōu)于免疫熒光法，對石蠟切片標(biāo)本尤為適用，為免疫病理研究開辟了一條新途徑，酶顯色產(chǎn)物具有較高的電子密度，經(jīng)過適當(dāng)處理還可以進行免疫電鏡觀察，免疫酶組化技術(shù)分為酶標(biāo)記法與非標(biāo)記抗體技術(shù)，前者是將酶通過交聯(lián)劑結(jié)合在抗體分子上，形成酶標(biāo)記抗體。后者是將酶作為抗原與相應(yīng)的特異性抗體連接進行的免疫反應(yīng)，稱為非標(biāo)記抗體酶技術(shù)。
western實驗步驟
組織裂解
(1)稱取100mg腦組織，剪碎后放入研缽中，然后加入液氮研碎組織，直至成粉末狀；
(2)加入1ml裂解液（裂解液中含有臨時加入的10μl蛋白酶抑制劑混合物），研磨，直至成為液體；
(3)轉(zhuǎn)至EP管，冰上靜置10min；
(4)4℃，12, 000r.p.m.，離心10min，取上清（胞漿蛋白）；
(5)－80℃，分裝凍存。
制備SDS-PAGE凝膠
(1)將灌膠玻璃板洗凈，晾干固定，確定灌制分離膠液面標(biāo)志線（距樣品梳子底部約0.5-1.0cm處）。
(2)配制10%分離膠8ml（見下表），快速灌入凝膠玻璃槽中，使其液面至標(biāo)志線位置（避免產(chǎn)生氣泡）。
(3)立即用去離子水覆蓋膠面（隔絕空氣，有助于凝膠聚合），室溫放置約40min至分離膠凝固。
(4)配制5%濃縮膠4ml（見下表）。
