學(xué)習(xí)中心
【樣本來源】
(1) 單層粘附細(xì)胞；
(2) 細(xì)胞懸液；
(3) 組織切片細(xì)胞提取物。
【材料與試劑】（Roche公司試劑盒）
(1) 鼠抗人－Fas-Biotin；
(2) 封閉緩沖液： 0.1mol/L Tris-HCL， 0.1% BSA（w/v）， 0.1% Tween 20（v/v）
(3) POD封閉液：含0.3% H2 O2 的甲醇液；
(4) 鏈霉親和素－POD（10mg/ml）
(5) 鏈霉親和素－熒光素（10mg/ml）
(6) DAB底物
【操作方法】
1、蛋白印跡法（western blotting）
(1) 準(zhǔn)備標(biāo)本，并經(jīng)SDS－PAGE分離；
(2) 將所分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF或NC膜；
(3) 用封閉緩沖液封閉非特異性結(jié)合位點，室溫1小時，輕柔振搖；
(4) 用抗－Fas-Biotin（1mg/ml）在含1％BSA的PBS液中室溫孵育1小時，輕柔振搖；
(5) TBST室溫洗膜2次，每次10min；
(6) 在鏈霉親和素－偶聯(lián)物即鏈霉親和素－POD中孵育；
(7) 在大容量的TBST中洗膜4次，每次15min；
(8) 在DAB中室溫孵育5～15min；
(9) 觀察結(jié)果。
2、流式細(xì)胞分析法
(1) 以PBS洗細(xì)胞（單層細(xì)胞或細(xì)胞懸液）；
(2) 在抗－Fas-Biotin（1:20稀釋）中孵育細(xì)胞；
(3) PBS中洗細(xì)胞2次；
(4) 于鏈霉親和素－熒光素溶液（10mg/ml）中室溫孵育30分鐘；
(5) PBS中洗細(xì)胞2次；
(6) 在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果或用PBS稀釋細(xì)胞后進(jìn)行流式細(xì)胞分析。
3、免疫組化法
(1) 已固定的組織或組織切片于APES－包被的玻片上，37℃干燥過夜；
(2) 將已干燥的切片置于混合二甲苯（xylol）中脫蠟，以梯度乙醇脫水；
(3) 將切片置于檸檬酸緩沖液以最高強(qiáng)度微波處理5x5分鐘，冷卻至室溫；
(4) 將玻片浸入PBS，用PBSA（PBS＋BSA）封閉，室溫20分鐘；
(5) 如需要，在POD封閉液中封閉內(nèi)源性POD，室溫作用30分鐘；
(6) 加入抗－Fas-Biotin溶液（1:20至1：100稀釋），37℃孵育30分鐘，
(7) PBSA洗玻片三次或浸泡洗滌；
(8) 于鏈霉親和素－POD溶液中室溫孵育30分鐘；
(9) PBS中洗玻片三次
(10) DAB底物反應(yīng)液中孵育直至呈現(xiàn)清晰可見的顏色；
(11) 蘇木素（hemalum）復(fù)染，封片，觀察結(jié)果。
【結(jié)果判斷】
蛋白印跡法：含有Fas抗原的膜成分呈現(xiàn)棕色條帶。
