摘要：90年代以來基因重組技術(shù)得到很大的發(fā)展，基因工程產(chǎn)品的分離純化的成本約占其全部成本的60%～80%，因此重組蛋白的分離純化技術(shù)越來越重要。本文主要介紹了沉淀、液液萃取、層析等常用分離重組蛋白方法的原理及應(yīng)用，旨在為開展蛋白質(zhì)的制備及其應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。
關(guān)鍵詞：重組蛋白質(zhì)；分離；純化；沉淀；液液萃?。粚游?；包涵體
隨著基因重組技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了很多基因工程產(chǎn)品，而作為基因工程技術(shù)的下游工程中的基因重組蛋白的分離純化技術(shù)越來越顯示其重要性。據(jù)有人統(tǒng)計(jì),基因工程產(chǎn)品的分離純化成本約占到其全部成本的60%～80%[1]。由此可見產(chǎn)品的分離純化是獲得目的產(chǎn)物的關(guān)鍵一步，也是比較困難的一步，它標(biāo)志著生物產(chǎn)業(yè)的高低。
純化重組蛋白質(zhì)和普通蛋白質(zhì)的不同就在于要選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)，因?yàn)楸磉_(dá)系統(tǒng)決定了細(xì)胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)物的性質(zhì)以及可能產(chǎn)生的雜蛋白，而純化重組蛋白質(zhì)的主要目的是去除雜蛋白質(zhì)，通常對(duì)一種重組蛋白質(zhì)的純化會(huì)采用多個(gè)系統(tǒng)[2]。但是重組蛋白有幾種不同的表達(dá)形式，如細(xì)胞外的分泌表達(dá)；細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)以及包涵體形式的存在，因此對(duì)于重組蛋白的純化要依據(jù)其表達(dá)形式的不同，采取不同的純化工藝。
與傳統(tǒng)方式相似，重組蛋白的分離純化也是利用其物理和化學(xué)性質(zhì)的差異，即以分子的大小、形狀、溶解度、等電點(diǎn)、親疏水性以及與其它分子的親和性等性質(zhì)建立起來的。目前主要的純化方法有濃縮沉淀法，層析和電泳技術(shù)。
重組蛋白質(zhì)在分離純化的過程中，必須維持一定的濃度和生物活性形式，以及防止被降解。因此從生物體中有效分離純化重組蛋白質(zhì)一直是個(gè)難題。90 年代以來,國內(nèi)外許多科學(xué)工作者在蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)和工藝上進(jìn)行了大量的研制和開發(fā),將原有的純化技術(shù)水平提高到一個(gè)新的高度。本文將簡單介紹一些傳統(tǒng)的分離純化方法，并介紹近10 年來重組蛋白分離純化中的新進(jìn)展和一些新出現(xiàn)的技術(shù)。
1 沉淀分離技術(shù)
1.1 鹽析法其原理是蛋白質(zhì)在高濃度鹽溶液中，隨著鹽濃度的逐漸增加，由于蛋白質(zhì)水化膜被破壞、溶解度下降而從溶液中沉淀出來。各種蛋白質(zhì)的溶解度不同,因而可利用不同濃度的鹽溶液來沉淀分離各種蛋白質(zhì)。鹽析法的特點(diǎn)是成本低,不需要特別設(shè)備，操作簡單、安全,對(duì)蛋白質(zhì)的一些生物活性成分破壞較少,缺點(diǎn)是選擇性不強(qiáng)。
1.2 有機(jī)溶劑沉淀法向蛋白質(zhì)溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有機(jī)溶劑，降低水的活度，隨著有機(jī)溶劑濃度的增大，水對(duì)蛋白質(zhì)分子表面荷電基團(tuán)或親水基團(tuán)的水化程度降低，溶液的介電常數(shù)下降，蛋白質(zhì)分子間的靜電引力增大，從而使蛋白質(zhì)凝聚和沉淀。其特點(diǎn)是：選擇性高；其次，沉淀后所得產(chǎn)品不需脫鹽，殘留的沉淀劑通過揮發(fā)即可除去。但是有機(jī)沉淀劑對(duì)具有生物活性的蛋白質(zhì)、酶類具有失活作用，因而常常需在低溫下進(jìn)行操作。
1.3 等電點(diǎn)沉淀法其原理是通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使兩性電解質(zhì)在溶液pH值處于等電點(diǎn)時(shí)，分子表面凈電為零，導(dǎo)致賴以穩(wěn)定的雙電層及水化膜的削弱或破壞，分子間引力增加，兩性電解質(zhì)的溶解度下降，從而沉淀析出。
1.4 變性沉淀法利用生物大分子物質(zhì)對(duì)物理、化學(xué)等外部環(huán)境因子敏感性的差異而選擇性地使一種組分發(fā)生變性形成沉淀，而另一些組分保持不變，從而達(dá)到分離、除雜和提純的目的。此方法包括：熱變性沉淀分離；酸堿變性沉淀分離；利用表面活性劑或有機(jī)溶劑引起變性沉淀分離；利用酶進(jìn)行變性分離。
2 液液萃取技術(shù)
液液萃取技術(shù)是常用分離技術(shù)之一，在生物化工中也有廣泛的應(yīng)用。然而，大部分生物物質(zhì)是有生物活性的，需要在低溫或室溫條件下進(jìn)行分離純化，而采用傳統(tǒng)萃取技術(shù)無法完成。
雙水相萃取技術(shù)是近年來發(fā)展很快的一種生物分離方法，與傳統(tǒng)的液液分離方法相比，雙水相萃取技術(shù)分離純化蛋白質(zhì)具有以下優(yōu)勢(shì)：蛋白質(zhì)在其中不易變性；分相時(shí)間短，一般只需5～15 min ；易于放大和進(jìn)行連續(xù)性操作；萃取環(huán)境溫和，生物相容性高；聚合物對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有穩(wěn)定和保護(hù)作用等[3]。近年來一些學(xué)者將雙水相萃取技術(shù)與膜分離技術(shù)結(jié)合起來，較好地解決了生物大分子在兩相界面的吸附和乳化作用并且加快了萃取速率。還有一些學(xué)者利用親和反應(yīng)的高度專一性，在萃取劑上接上一定的親和配基，使得雙水相萃取體系不僅具有處理量大的特點(diǎn)，而且具有專一性，提高了萃取效率。
液液反膠團(tuán)(Reversed Micelles ,RM) 體系萃取技術(shù)是90 年代以來發(fā)展較快的另一種萃取技術(shù), 是依賴表活劑液液萃取技術(shù)的一個(gè)分支 [4]。反膠團(tuán)是離子型表面活性劑分散在非極性溶液中形成的,由表活劑的極性頭向內(nèi)形成一個(gè)圍繞“水核”的納米級(jí)微團(tuán)[5]。在這微團(tuán)中由于表活劑極性頭的保護(hù)，可使包溶的的蛋白質(zhì)不易變性。此外反膠團(tuán)萃取體系還具有操作條件溫和，對(duì)目標(biāo)蛋白選擇性好，容量大和易于擴(kuò)大再生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)然反膠團(tuán)體系萃取技術(shù)也有其不足之處，以往采用單一表活劑AOT 或季氨鹽的反膠團(tuán)萃取體系易受溶液pH、溫度、離子強(qiáng)度和離子種類等因素的影響。目前為了克服這些缺點(diǎn)，往往在反膠團(tuán)體系中加其它表活劑作助劑或者采用陰、陽和非離子復(fù)合型表活劑的反膠團(tuán)體系的方法來解決[6]。
3 層析法
3.1 離子交換層析原理是用離子交換劑作為吸附劑，將溶液中的離子依靠靜電引力吸附在吸附劑上，同時(shí)從吸附劑上置換出另一種離子，然后用適當(dāng)?shù)娜芤簩⑽轿飶奈絼┥现脫Q下來，進(jìn)行濃縮富集，從而達(dá)到分離的目的。其吸附作用來自離子間的靜電作用。
蛋白質(zhì)為兩性物質(zhì)，不同的pH，所帶的電荷也不同。不同的pH和不同的離子強(qiáng)度下，蛋白質(zhì)在不同的離子交換樹脂上的吸附程度也不同。如果能夠選擇適當(dāng)?shù)臈l件，對(duì)蛋白質(zhì)的分離純化能起到事半功倍的效果。多數(shù)蛋白對(duì)酸堿不太穩(wěn)定，因此對(duì)蛋白來說多用弱離子交換樹脂。有一類特殊的商品化離子交換樹脂，Sigma產(chǎn)品目錄上成為聚緩沖液交換劑。先用某一pH緩沖液平衡聚緩沖液交換劑，再用另一pH緩沖液平衡，就能在這種離子交換劑上建立一個(gè)pH梯度。上樣后，用一種具有pH梯度的聚緩沖液洗脫樹脂時(shí)，被吸附樣品中的蛋白質(zhì)就能按照他們的等電點(diǎn)次序被依次洗脫。在這個(gè)過程中，同時(shí)產(chǎn)生聚焦作用，致使個(gè)蛋白質(zhì)分級(jí)變得很窄，樣品高度濃縮，整個(gè)分離過程也呈現(xiàn)出很高的分辨率，稱為層析聚焦技術(shù)[7]。
3.2 疏水層析蛋白質(zhì)內(nèi)部有疏水部分，蛋白質(zhì)表面常存在非極性氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸）形成疏水區(qū)、蛋白質(zhì)的疏水程度取決于暴露的或埋藏的氨基酸的疏水性之和。疏水性氨基酸的數(shù)目、疏水性及他們的分布形成了蛋白質(zhì)的特性。不同的蛋白質(zhì)分子的疏水性強(qiáng)弱有較大差異。疏水層析就是利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團(tuán)（疏水性配基）的疏水性吸附為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)分離純化的方法。
在離子強(qiáng)度較高的鹽溶液中，蛋白質(zhì)表面疏水部位的水化層被破壞，暴露出疏水部位，疏水性相互作用增大。故蛋白質(zhì)在疏水性吸附劑上的分配系數(shù)隨流動(dòng)相鹽析鹽濃度（離子強(qiáng)度）的提高而增大。因此，疏水層析中蛋白質(zhì)的吸附需在高濃度鹽溶液中進(jìn)行，而洗脫則主要采用降低流動(dòng)相離子強(qiáng)度的線性梯度洗脫法或逐次洗脫法。
由于疏水層析分析純化蛋白質(zhì)的原理與離子交換層析完全不同，因此疏水層析與離子交換層析互補(bǔ)短長，用于離子交換層析難以分離的蛋白。周維國等人以O(shè)ctyl Sepharose 4 Fast Flow為層析介質(zhì)分離硫酸銨分步沉淀法制備的重組蛋白MSH-Ang粗純化樣品，,回收率達(dá)85%,重組蛋白MSH-Ang純度達(dá)65%以上[8]。
3.3 反相層析反相層析利用表面非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機(jī)溶劑的水溶液為流動(dòng)相，根據(jù)溶質(zhì)極性（疏水性）的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離純化。與疏水層析相似，反相層析中溶質(zhì)也是通過疏水性相互作用分配于固定相表面。但是反相層析固定相表面完全被非極性基團(tuán)所覆蓋，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的疏水性，必須采用極性有機(jī)溶劑（如甲醇、乙腈等）或水溶液進(jìn)行溶質(zhì)的洗脫分離，多采用降低流動(dòng)相極性（水含量）的線性梯度洗脫法。
反相層析主要用于相對(duì)分子量較小的蛋白質(zhì)的分離純化。其中運(yùn)用最廣泛的是反相液相色譜。Boyes等報(bào)道了用連續(xù) RPLC 對(duì)細(xì)菌原液中的重組人淀粉狀蛋白前體多肽片段進(jìn)行分離[9]。
3.4 親和層析許多生物活性物質(zhì)具有與其他某些物質(zhì)可逆結(jié)合的性質(zhì)，生物物質(zhì)的這種結(jié)合能力成為親和力。生物親和力具有高度的特異性，即一種生物物質(zhì)只能與另一種特定的物質(zhì)結(jié)合。親和層析是將有親和力吸附作用的物質(zhì)分子（配基）偶聯(lián)在固體介質(zhì)（載體）上作為固定相，用以分離純化目的蛋白的方法。
親和層析具有高度的選擇性、分辨率和載量優(yōu)的特點(diǎn)，只需要一步處理便可從一個(gè)混雜有多種高濃度無關(guān)蛋白質(zhì)的復(fù)雜材料中純化出少量的目的蛋白，純化系數(shù)可達(dá)數(shù)千倍，回收率很高，并且對(duì)純化物有濃縮效果，是分離純化蛋白質(zhì)的有力工具。
根據(jù)配體與生物大分子之間相互作用體系的不同，可以把親和層析分為以下四種類型。
3.4.1.生物親和層析
利用自然界中存在的生物特異性相互作用物質(zhì)對(duì)的親和層析。典型的物質(zhì)對(duì)有酶-底物、酶-抑制劑、激素-受體等。陳嫚用交聯(lián)瓊脂糖為載體,三聚氯氰為活化劑,刺桐胰蛋白酶抑制劑為配基,制備親和填料，再用此親和填料吸附重組人組織型纖溶酶原激活劑突變體( reteplase，r-PA )，得到高純度的r-PA[10]。林敏等將編碼有一個(gè)血吸蟲谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)基因的pGEX表達(dá)載體與重組基因進(jìn)行融合表達(dá),其表達(dá)產(chǎn)物易為GSTrapTM親和層析柱中的GST單體特異性吸附,洗脫,濃縮后經(jīng)5%NaHCO3特殊處理而獲得高純度的重組融合蛋白[11]。GST柱具有純化條件溫和、蛋白回收率高的優(yōu)點(diǎn),但它的非特異性吸附過高,如對(duì)純度要求不高時(shí),可作為較好的選擇。
3.4.2.免疫親和層析
利用抗原抗體中的一方為配體，親和吸附另一方的分離系統(tǒng)，稱免疫親和層析。許多典型的親和層析純化蛋白質(zhì)的過程已經(jīng)使用了單克隆抗體作為親和配體。目前,利用抗體-抗原模式,有可能得到每一種目標(biāo)蛋白的單抗,然后以單抗為配基,通過親和層析技術(shù)分離純化重組蛋白。此種方法的純化倍數(shù)、活性回收率非常高。
FLAG融合標(biāo)簽是由八個(gè)氨基酸(AspTyrLysAspAspAspAspLys)組成的短肽,專門設(shè)計(jì)用于重組蛋白質(zhì)的免疫吸附純化。利用FLAG融合標(biāo)簽可以建立一個(gè)基于融合多肽的高效檢測和純化系統(tǒng)。FLAG標(biāo)簽結(jié)構(gòu)短小,且與融合蛋白質(zhì)之間含有一個(gè)腸激酶切割位點(diǎn),可以通過腸激酶切割被除去?，F(xiàn)已發(fā)展出了M1、M2和M5三種抗-FLAG單克隆抗體,FLAG融合抗原標(biāo)簽技術(shù)已經(jīng)廣泛用于重組蛋白質(zhì)的純化[12]。
陳登鴻就用單克隆抗體親和層析一步純化重組人生長激素[13]。
3.4.3.固定化金屬離子親和層析
利用金屬離子的絡(luò)合物或形成螯合物的能力吸附蛋白質(zhì)的分離系統(tǒng)。目的蛋白質(zhì)表面裸露的供電子氨基酸殘基,如組氨酸的咪唑基,半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基,十分有利于蛋白質(zhì)與固定化金屬離子結(jié)合。洗脫時(shí),通過改變pH，加競爭的螯合試劑等方法，依據(jù)各蛋白組分與介質(zhì)的親和程度不同將目標(biāo)蛋白與雜蛋白分離。這是固定化金屬離子親和層析用于蛋白質(zhì)分離純化的根據(jù)。已發(fā)現(xiàn)金屬離子如鋅離子和銅離子能很好地與組氨酸的咪唑基及半胱氨酸的巰基結(jié)合。金屬離子親和層析具有分辨率高選擇性好的特點(diǎn)，給分離蛋白質(zhì)帶來了很大方便。
冉波等利用鎳離子親和層析純化獲得帶有六聚組氨酸尾的口蹄疫病毒VP1epi重組蛋白[14]。張懷等人以Ni2+-IDA-Sepharose Fast Flow為層析介質(zhì),在變性條件下以咪唑和pH洗脫方式對(duì)Hepcidin(鐵調(diào)素)融合蛋白進(jìn)行純化,純化后的融合蛋白純度大于95 %,而且不含咪唑,有利于下一步鐵調(diào)素的制備[15]。金屬螯合親和層析的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是層析過程既可以在常規(guī)的非變性條件下進(jìn)行純化又可以應(yīng)用于含6mol/L鹽酸胍或8mol/L尿素的變性條件。這一優(yōu)點(diǎn)尤其對(duì)以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白純化尤為有利[16]。
在實(shí)際應(yīng)用過程中金屬螯合親和層析填料大都采用瓊脂糖為介質(zhì)，而瓊脂糖顆粒表面較為粗糙,容易產(chǎn)生一些非特異性吸附現(xiàn)象。這一現(xiàn)象尤其出現(xiàn)在小量蛋白的分離或含疏水性蛋白多的情況中，而且也不適應(yīng)快速分離蛋白，大大影響了金屬螯合層析的分離效果。針對(duì)這一情況，90年代以來國外的一些科學(xué)家采用磁化或超順磁化介質(zhì)克服了這一缺點(diǎn)[17]。含有氧化鐵的交聯(lián)瓊脂糖是常用的磁化填料，它們的顆粒非常細(xì),表面極其光滑，將蛋白的非特異吸附降到最低的水平。美國的Qiagen公司已將此技術(shù)利用到商品化。
近年來，人們還將基因重組技術(shù)與金屬螯合層析結(jié)合起來，在基因水平上為蛋白質(zhì)的分離純化提供方便。其基本原理是在目的基因的N端或C端加上6個(gè)His,這樣表達(dá)出的蛋白就可以直接用于金屬螯合層析當(dāng)中。QIAexpress系統(tǒng)就是美國Qiagen公司提供的商品化的試劑盒。該系統(tǒng)利用的pQE系列載體不僅有6個(gè)His編碼序列還含有強(qiáng)啟動(dòng)子和多克隆位點(diǎn)等成分，可以將目的基因在宿主細(xì)胞中高效表達(dá)。表達(dá)后的產(chǎn)物可直接用金屬螯合層析進(jìn)行分離,有時(shí)可取得一步純化的效果[18]。
3.4.4.擬生物親和層析
擬生物親和層析是利用部分分子相互作用，模擬生物分子結(jié)構(gòu)或某特定部位，以人工合成的配基為固定相吸附目的蛋白質(zhì)的親和層析。如染料親和層析(DAFC)和氨基酸親和層析(包括多肽親和層析(AALA) [13]。染料配基，例如三嗪(Triazine)或三苯甲烷化合物，能通過共價(jià)鍵牢固地結(jié)合到親和載體上。
此外，國內(nèi)外許多科學(xué)工作者在蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)和工藝上進(jìn)行了大量的研制和開發(fā),將原有的純化技術(shù)水平提高到一個(gè)新的高度，主要有AKTA系統(tǒng)、擴(kuò)張柱床吸附層析、徑向膜層析、灌注層析、置換層析等。
置換層析的分離原理是被吸附的各組分對(duì)固定相吸附部位的直接競爭作用的結(jié)果,依據(jù)與固定相的親和性不同在置換劑的推動(dòng)下,形成一系列已分離的置換序列[14]。
置換層析與傳統(tǒng)洗脫層析的比較見下表：
表1置換層析與傳統(tǒng)洗脫層析的比較
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置換層析 |
傳統(tǒng)洗脫層析 |
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分離機(jī)理 |
被吸附組分之間對(duì)固定,相親和性大小不同 |
吸附的平衡常數(shù)不同導(dǎo)致各組分在流動(dòng)相中有不同的速度 |
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洗脫峰形 |
矩形的平臺(tái)洗脫峰形 |
鐘罩形洗脫峰形 |
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上樣量 |
飽和吸附量的40%~60% |
飽和吸附量的5% |
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樣品洗脫后濃度 |
濃縮狀態(tài)分離 |
稀釋狀態(tài)分離 |
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有無拖尾 |
無 |
有 |
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分辨率 |
極高 |
高 |
置換層析常常用于分離其他層析技術(shù)無法去除的分子量大小和帶電荷數(shù)均與目的蛋白極為相似的雜蛋白，甚至可以去除目的蛋白的折疊異構(gòu)物。置換層析的另一大優(yōu)點(diǎn)是在高分辨率的情況下依然保持很高的上樣量,這無疑為重組蛋白的生產(chǎn)提供了有效的手段。
4 重組蛋白包涵體的分離純化
4.1 包涵體的形成包涵體形成的原因：(1)高水平表達(dá)時(shí)，疏水作用和離子作用以及蛋白質(zhì)自身的錯(cuò)誤折疊導(dǎo)致表達(dá)蛋白在宿主細(xì)胞胞質(zhì)中形成包涵體；(2)宿主細(xì)胞內(nèi)的還原性環(huán)境使表達(dá)蛋白二硫鍵穩(wěn)定性下降，出現(xiàn)錯(cuò)配二硫鍵；(3)宿主細(xì)胞蛋白酶對(duì)異源蛋白的降解作用；(4)原核細(xì)胞內(nèi)缺乏真核生物蛋白質(zhì)的加工與修飾系統(tǒng)；蛋白質(zhì)形成的動(dòng)力學(xué)研究表明：蛋白質(zhì)折疊是一個(gè)產(chǎn)熱過程，多種蛋白質(zhì)在體內(nèi)折疊過程中均有不耐熱的中間體形成，這些中間體在宿主細(xì)胞溫度升高時(shí)成為包涵體的前體物質(zhì)，隨后聚合成包涵體[21]。
4.2 包涵體對(duì)分離純化的影響
在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的重組蛋白多以無活性的包涵體形式存在，需復(fù)性為活性蛋白分子才能加以應(yīng)用。實(shí)踐證明，包涵體對(duì)蛋白質(zhì)的分離純化有幾方面的影響：(1)可以很容易的與胞內(nèi)可溶性蛋白雜志分離，使得分離純化較容易完成。包涵體具有高密度，對(duì)機(jī)械攪拌和超聲破碎不敏感，并且在水溶液中通常不溶，因此可以通過簡單的離心就可以分離得到，并且可以較容易的與胞內(nèi)可溶性的雜質(zhì)蛋白分離，有利于表達(dá)蛋白的分離純化；(2)包涵體可以從勻漿液中以低速離心出來，以促溶劑(如尿素、鹽酸胍、SDS)溶解，在適當(dāng)條件下(pH、離子強(qiáng)度與稀釋)復(fù)性，產(chǎn)物經(jīng)過一個(gè)變形的過程，較易形成錯(cuò)誤折疊和聚合體；(3)包涵體的形成雖然增加了提取的步驟，但包涵體中目的蛋白的純度較高，可達(dá)20%~80%，且重組蛋白以包涵體的形式表達(dá)能有效地抵御如大腸桿菌中蛋白酶對(duì)表達(dá)蛋白的降解；(4)對(duì)于生產(chǎn)那些處于天然構(gòu)象時(shí)對(duì)宿主細(xì)胞有毒害的蛋白，包涵體的形成無疑是最佳的選擇。
4.3 包涵體蛋白的分離純化
4.3.1.包涵體的分離純化
用機(jī)械或超聲等方法粉碎細(xì)菌，離心后取沉淀。由于包涵體相對(duì)穩(wěn)定。可在去垢劑溶液或低濃度變性劑(如尿素)中初步洗滌純化，而進(jìn)一步純化目前多用凝膠電泳(如SDS-PAGE、微過濾電泳等)、超濾／透析及各種色譜方法分離，常用的色譜方法有固定金屬離子親和色譜(如Ni—NTA親合色譜)、Sepharose離子交換色譜、反相高教液相色譜(HPLC)、分子篩(SephadexoG-10)凝膠柱層析等。
具體選用何種工藝需要根據(jù)不同的重組蛋白而定，但在選擇方法時(shí)基本要遵從以下原則：(1)選擇能夠最有效利用不同性質(zhì)進(jìn)行分離的方法；(2)盡可能用高得率的步驟；(3)把比較費(fèi)事的和能有效提高純度的步驟放到最后去做。
4.3.2.包涵體蛋白的溶解與還原
為了將包涵體中非天然折疊的多肽鏈打開，用高濃度的尿素和鹽酸胍結(jié)合還原劑還原并溶解但涵體蛋白，但高濃度的尿素和鹽酸胍會(huì)便蛋白質(zhì)完全變性，不利于隨后的復(fù)性。 Tris緩沖液、TritonX一100，強(qiáng)陰離子及陽離子表面活性劑(N一十六烷基吡啶氧化物、十六烷基三甲基氯化銨等)等溶劑則能使包涵體蛋白保持部分活性，從而提高重組蛋白的復(fù)性率。
4.3.3.包涵體蛋白的復(fù)性
蛋白質(zhì)復(fù)性過程同時(shí)受到動(dòng)力學(xué)及熱力學(xué)因素的影響。形成天然活性蛋白質(zhì)要求形成正確的二硫鍵及相互作用的結(jié)構(gòu)域單元。所以，常在復(fù)性液中加入還原／氧化的巰基促進(jìn)正確二硫鍵的形成。
復(fù)性前通常用稀釋、透析、凝膠過濾層析等方法除去變性劑以促進(jìn)復(fù)性，低濃度變性劑有助于提高活性蛋白最終產(chǎn)量，故復(fù)性液中常需加入一定濃度的變性劑 J。復(fù)性時(shí)加入低分子量添加劑(如L-精氨酸、去垢劑、Ca2+ 等)抑制蛋白聚集或利用基質(zhì)結(jié)合技術(shù)也可提高復(fù)性率。
一般的復(fù)性方法是在低濃度蛋白質(zhì)的條件下，用空氣氧化或還原／氧化谷胱甘肽氧化法促進(jìn)變性蛋白質(zhì)復(fù)性，復(fù)性率低。使用含有還原劑的陽離子表面活性劑(N-十六烷基吡啶氧化物)可一步溶解及復(fù)性包涵體蛋白，不需進(jìn)一步的快速稀釋或透析即能提高復(fù)性率。用堿性溶液溶解包涵體并用強(qiáng)陰離子交換劑固定蛋白，則可在相當(dāng)高的濃度一步進(jìn)行蛋白的純化與復(fù)性，克服了復(fù)性必需在低蛋白濃度的限制。反相微團(tuán)是表面活性劑在有機(jī)溶劑中形成的納米水平(1～10nm)的水相液滴，能在接近中性、低鹽濃度的條件下純化、抽提蛋白質(zhì)，反相微團(tuán)的水相池中溶解的蛋白質(zhì)可保持部分活性，是一種快速、可連續(xù)操作、有潛力的液提取技術(shù)，適用于重組蛋白的大批量生產(chǎn)
綜上所述，一般首先是菌體破碎，放出包涵體，包涵體經(jīng)多次不同溶液洗滌后，溶解，然后利用柱層析純化。純化后蛋白用復(fù)性劑恢復(fù)蛋白活性。大致程序如此，其間可能由于不同蛋白或工藝需要，采用不同方法純化，但基本以此程序?yàn)闇?zhǔn)[22]。
4.4 復(fù)性蛋白質(zhì)的檢測蛋白質(zhì)的復(fù)性必須要有相應(yīng)的檢測方法，以鑒定復(fù)性蛋白質(zhì)的生化、免疫學(xué)、物理性質(zhì)及蛋白變性態(tài)與天然態(tài)的區(qū)別，檢測的方法可以幫助優(yōu)化復(fù)性方法和復(fù)性條件。最常見的方法有以下幾種[23]：
(1) 凝膠電泳 其中最常用的是還原和非還原的SDS-PAGE，適于鑒定產(chǎn)物的純度及復(fù)性蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)。
(2) 色譜學(xué)方法 主要利用蛋白質(zhì)的色譜保留行為來研究已復(fù)性蛋白質(zhì)、折疊中間體、聚集體與天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)的構(gòu)象差異。最常用的色譜方法是凝膠排阻色譜(SEC)和反相高效液相色譜(RP-HPLC).
(3) 光譜學(xué)方法 主要有紫外色譜、熒光色譜和圓二色譜CD等，這些方法可用來研究蛋白質(zhì)復(fù)性過程中構(gòu)象的變化，特別用于鑒定折疊中間體和復(fù)性蛋白質(zhì)的構(gòu)象。
(4) 黏度與濁度 蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)不同，其溶解度存在一定差異，從而影響其黏度的變化，因此可以通過測定溶液的濁度來反映蛋白質(zhì)聚集的快慢與程度，通常檢測600nm或400nm處的吸光度。
(5) 免疫學(xué)方法 利用酶聯(lián)免疫、蛋白印跡測定不同狀態(tài)蛋白質(zhì)的抗體-抗原結(jié)合力的差異，來測定不同狀態(tài)蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。
(6) 生物學(xué)活性及比活性的測定 這是一個(gè)對(duì)最后的折疊狀態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，一般通過動(dòng)物或細(xì)胞模型直接測定復(fù)性蛋白所具有的生物學(xué)效應(yīng)來表示。
4.5 重組Prohibitin融合蛋白包涵體的純化
Prohibitin是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種分子量為29．8kD、與腫瘤有關(guān)的蛋白。由異丙基一β—D硫代半乳糖苷(IPTC)誘導(dǎo)重組大腸桿菌BL2l(pET30a(+)-prohibitin)表達(dá)，其融合蛋白包涵體經(jīng)過離心、超聲破碎、洗滌、變性、復(fù)性后，用Ni—NTA Agarose親和層析柱分離純化 通過12％ SDS—PAGE膠和Bradford法檢測其純度和目的蛋白含量，用ELISA對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行鑒定，純度達(dá)90％以上。含量約0.3mg／ml[24]。
蛋白質(zhì)的分離和提純工作是一項(xiàng)艱巨而繁重的任務(wù)，由于重組蛋白在組織和細(xì)胞中仍以復(fù)雜混合物的形式存在，因此到目前為止還沒有一個(gè)單獨(dú)或一整套現(xiàn)成的方法把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中分離出來,而只能依據(jù)目標(biāo)蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)摸索和選擇一套綜合上述方法的適當(dāng)分離程序，以獲得較高純度的制品。綜觀重組蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)的新進(jìn)展,我們可以看到這樣一個(gè)發(fā)展趨勢(shì):今后重組蛋白的分離純化的技術(shù)發(fā)展將圍繞著快速,高分辨率,高上樣量,易于操作,低成本和電腦控制的全自動(dòng)化等技術(shù)而展開。希望今后科學(xué)工作者能找出更多更好的方法來提純蛋白質(zhì)。
