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1 前言
RNA是生物體內(nèi)最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，它與DNA和蛋白質(zhì)一起構(gòu)成生命的框架。但長久以來，RNA分子一直被認為是小角色。它從DNA那兒獲得自己的順序，然后將遺傳信息轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)。然而，一系列發(fā)現(xiàn)表明——這些小分子RNA事實上操縱著許多細胞功能。它可通過互補序列的結(jié)合反作用于DNA，從而關(guān)閉或調(diào)節(jié)基因的表達。甚至某些小分子RNA可以通過指導(dǎo)基因的開關(guān)來調(diào)控細胞的發(fā)育時鐘。
2 綜述
2.1 研究歷史與發(fā)展前景
2.1.1 定義
雙鏈RNA對基因表達的阻斷作用被稱為RNA干預(yù)（RNA interference, RNAi ）雙鏈RNA經(jīng)酶切后會形成很多小片段，稱為siRNA，這些小片段一旦與信使RNA(mRNA)中的同源序列互補結(jié)合，會導(dǎo)致mRNA失去功能，即不能翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)，也就是使基因“沉默”了。
2.1.2 研究歷史
RNAi現(xiàn)象早在1993年就有報道： 將產(chǎn)生紫色素的基因轉(zhuǎn)入開紫花的矮牽牛中，希望得到紫色更深的花，可是事與愿違，非但沒有加深紫色，反而成了白色。當時認為這是矮牽牛本來有的紫色素基因和轉(zhuǎn)入的外來紫色素基因都失去了功能，稱這種現(xiàn)象是“共抑制”。1995年，康奈爾大學(xué)的Su Guo博士用反義RNA阻斷線蟲基因表達的試驗中發(fā)現(xiàn)，反義RNA（anti sense RNA和正義RNA（sense RNA）都阻斷了基因的表達，他們對這個結(jié)果百思不得其解。直到1998年，Andrew Fire的研究證明，在正義RNA阻斷了基因表達的試驗中，真正起作用的是雙鏈RNA。這些雙鏈RNA是體外轉(zhuǎn)錄正義RNA時生成的。于是提出了RNAi這個詞。
2.1.3 作用機理
目前RNAi的作用機理主要是在線蟲，果蠅，斑馬魚等生物體內(nèi)闡明的。生物體內(nèi)的雙鏈RNA可來自于RNA病毒感染，轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，外源導(dǎo)入的基因。這些來源的雙鏈RNA誘發(fā)了細胞內(nèi)的RNAi機制，結(jié)果是病毒被清除，轉(zhuǎn)座子的表達被阻斷，外源導(dǎo)入基因表達被阻斷同時，與其同源的細胞基因組中的基因表達也被阻斷。
雙鏈RNA進入細胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP（以RNA為模板指導(dǎo)RNA合成的聚合酶，RNA-directed RNA polymerase）的作用下自身擴增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的雙鏈解開變成單鏈，并和某些蛋白形成復(fù)合物，Argonaute2是目前唯一已知的參與復(fù)合物形成的蛋白。此復(fù)合物同與siRNA互補的mRNA結(jié)合，使mRNA被RNA酶裂解。
另一方面結(jié)合的產(chǎn)物以SiRNA作為引物，以mRNA為模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互補鏈。結(jié)果mRNA也變成了雙鏈RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。這些新生成的siRNA也具有誘發(fā)RNAi的作用，通過這個聚合酶鏈式反應(yīng)，細胞內(nèi)的siRNA大大增加，顯著增加了對基因表達的抑制。從21到23個核苷酸的siRNA到幾百個核苷酸的雙鏈RNA都能誘發(fā)RNAi，但長的雙鏈RNA阻斷基因表達的效果明顯強于短的雙鏈RNA。
siRNA還能夠通過某種不太明了的機制永久地關(guān)閉或者刪除DNA片斷，以在非常大的程度上控制染色質(zhì)的形成，而不是僅僅暫時地抑制它們的活動。
動植物和人體的病原體中有一些是RNA病毒，如導(dǎo)致艾滋病的HIV和SARS的冠狀病毒都是RNA病毒。有些RNA病毒在復(fù)制過程的一定階段中會產(chǎn)生雙鏈RNA。如果宿主體內(nèi)有分解這種雙鏈RNA的酶，就可將雙鏈RNA降解。
反義RNA技術(shù)改良
用反義RNA分子來調(diào)節(jié)基因表達時，經(jīng)常會遇到的困難是反應(yīng)模板的穩(wěn)定性差。因此，人們正在探索如何改進反義基因的新方法，目前主要有：
?。?）優(yōu)化反義RNA的結(jié)合。反義RNA鏈的長度對抑制基因的效果是重要的。雙螺旋形成過程中將釋放能量，RNA鏈越長，釋放的自由能越多。從這一意義來講，可以說長RNA作為反義RNA更有效。但是，并沒有關(guān)于反義RNA長度的一般規(guī)則。Nellen和Lichtentein曾指出，有關(guān)反義RNA技術(shù)的一個普遍問題是，怎樣使反義RNA更有效，即怎么樣使一個互補的RNA成為有效的反義RNA。在植物中覆蓋整個cDNA的反義RNA有效地抑制了基因表達。但是，與5¹或3¹端部分mRNA互補的反義RNA效果同樣好。最小的反義RNA只有41個核苷酸。
反義RNA的二級結(jié)構(gòu)對雙螺旋的形成至關(guān)重要。因為形成雙鏈結(jié)構(gòu)必須克服正義和反義RNA本身的二級結(jié)構(gòu)，比潛在自由能的絕對量更重要的是形成雙螺旋的作用能量，也就是說，雙螺旋構(gòu)象是由動力學(xué)控制的，而不是由釋放的自由能的絕對量控制的。原核生物中自然發(fā)生的RNA可以很好的說明RNA結(jié)構(gòu)與形成雙螺旋構(gòu)象的速度之間的復(fù)雜關(guān)系。Simons和Kleckner指出，許多非常有效的反義RNA通常較短（約70個核苷酸），含有一個典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。例如大腸桿菌R1質(zhì)粒的拷貝數(shù)受反義 RNA cop A的控制。Nordstroem和合作者詳細研究了這一系統(tǒng)，其正義和反義RNA由同一DNA編碼，但以相反方向轉(zhuǎn)錄。因此，點突變一點也不能改變這兩種RNA的互補性，但是當同時改變正義和反義RNA環(huán)區(qū)時，雖然兩條RNA鏈完全互補，但結(jié)合率下降了三至四倍。與此同時，質(zhì)?？截悢?shù)卻增加了。很顯然，結(jié)合率受正義和反義RNA二級結(jié)構(gòu)的影響。兩條RNA鏈形成雙螺旋的初始“吻合”結(jié)構(gòu)非常重要。
毫無疑問，內(nèi)源的正義RNA不能被改變，但反義RNA的靶結(jié)合區(qū)及反義RNA的長度是可以改變的。這將影響反義RNA的二級結(jié)構(gòu)，從而改變其結(jié)合能力，使其與靶RNA結(jié)合更有效。Rittner等令人信服地證明了反義RNA的長度與它的結(jié)合率之間的復(fù)雜關(guān)系。他們用一個5¹端長度固定的人免疫缺陷型I型病毒（HIV-I）的反義RNA，改變其3¹端，從而改變了RNA長度。然后選擇能夠快速結(jié)合的反義RNA，發(fā)現(xiàn)結(jié)合率長度之間的關(guān)系依長度和相應(yīng)二級結(jié)構(gòu)的不同而擺動。3¹端只有幾個核苷酸不同的反義RNA結(jié)合率變化可達上百倍。這與反義RNA的二級結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。而且，體外的結(jié)合率與體內(nèi)抑制HIV-I增值的有效性一致。這些結(jié)果也證明了在體內(nèi)應(yīng)用反義RNA抑制靶基因之前，在離體條件下實驗的重要性。
在優(yōu)化反義RNA的實際長度以前，也可以用計算機輔助分析靶RNA，以尋找有效的靶RNA序列，通過設(shè)置一個50~400核苷酸的窗口，Sczakiel等設(shè)計了基因組和非基因組HIV RNA的能量。這些能量反映了區(qū)域折疊能力。觀察到高△G值（低自由能）區(qū)域與抑制HIV復(fù)制的最有效區(qū)相對應(yīng)。
?。?）延長反義RNA的半衰期。原核生物中自然發(fā)生的反義RNA極其穩(wěn)定，可能是由于它們特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)保護它們免受核酸外切酶的降解。據(jù)報道，通過控制插入序列IS10的RNA-OUT，能在體內(nèi)穩(wěn)定存在70 min，達三代之久。在反義RNA的末端加上這些保護性的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，可以減少核酸外切酶的降解。Heinrich等應(yīng)用了這一方法。最近，Bourque和Folk報道，一個變相方法是把反義RNA與tRNA連接，用一個依賴于DNA的RNA聚合酶III特異啟動子來表達。
?。?）在細胞質(zhì)中表達反義RNA。另一個能夠獲得高水平表達的反義RNA的方法是在一個游離的復(fù)制系統(tǒng)中表達反義基因。這種系統(tǒng)不同于轉(zhuǎn)基因于細胞核內(nèi)染色體上。已有幾個應(yīng)用植物RNA病毒作為載體的系統(tǒng)，在細胞質(zhì)中表達反義RNA。Joshi等用螢火蟲螢光素酶基因代替了大麥條斑病毒（BSMV）RNA β的開放讀碼框b，并且在轉(zhuǎn)染煙草和玉米原生質(zhì)體時表達；Donson等用一個以TMV為基礎(chǔ)的載體來產(chǎn)生細菌新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPT II）。Chapman等應(yīng)用馬鈴薯病毒X（PVX）為載體，表達了β-葡萄糖苷酸酶（GUS）。Dolja等把GUS插入到煙草蝕刻病毒（TEV）的多聚蛋白中，得到了表達。因此，在這樣的系統(tǒng)中表達反義RNA是完全可行的。劉博林等借助于Chapman等的PVX載體表達系統(tǒng)，在野生煙草（N. clevelandii）細胞質(zhì)中成功表達了對應(yīng)于plum pox virus（PPV）的反義RNA和酶性RNA。這為在細胞質(zhì)中抑制RNA病毒的復(fù)制研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
RNA制備的技術(shù)問題
1、RNase 是RNA制備的殺手
RNase酶非常穩(wěn)定，是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)。它在一些極端的條件可以暫時失活，但限制因素去除后有迅速復(fù)性。用常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能使RNase完全失活。它廣泛存在于人的皮膚上，因此，在與RNA制備有關(guān)的分子生物學(xué)實驗時，必須戴手套。RNase的另一污染源是取液器。根據(jù)取液器制造商的要求對取液器進行處理。一般情況下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部，基本達到要求。取RNase-free的物品時必須戴手套。
2、塑料制品、玻璃和金屬物品的處理
(a)塑料制品：盡可能使用無菌，一次性塑料制品。已標明RNase-Free 的塑料制品，如沒有開封使用過，通常沒有必要再次處理。對于國產(chǎn)塑料制品，原則上都必須處理方可使用。處理方法如下：
(1)在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使DEPC的終濃度為0.1%。注意：DEPC為劇毒物，活性很強，小心在通風柜中使用。
(2)將待處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
(3)在通風柜中室溫處理過夜。
(4)將DEPC水溶液小心倒到廢液瓶中，用鋁箔封住含已DEPC水處理過的塑料制品的燒杯，高溫高壓蒸氣滅菌至少30分鐘。
(5)烘箱用合適的溫度烘拷至干燥。置于干凈處備用。
(b)玻璃和金屬物品
250°C烘烤3小時以上。
3、什么時候需要分離mRNA?
答：常規(guī)RT-PCR鑒定基因表達水平的，一般都可以采用總RNA作為RT-PCR 的模板，但是做cDNA文庫，克隆豐度極低的基因，大多數(shù)DD-PCR， 削減雜交等需要純化的mRNA。一般用oligo (dT)-cellulose或在磁珠上偶連oligo (dT)，從組織或總RNA種直接分離mRNA。
4、如何判定分離的總RNA的純度？
答：需要從兩個方面著手，缺一不可，特別是新手（1）測定OD260/OD280的比值，測定時，RNA需要用10mM Tris-HCl,pH7.5稀釋。理想的RNA, OD260/280在1.9-2.1之間。比值如果過低，可能有蛋白質(zhì)污染，過高RNA可能已發(fā)生降解。（2）瓊脂糖變性電泳觀察rRNA的完整性和強度。變性電泳需要采用MOPS系統(tǒng)，不可以采用DNA 電泳用的TBE或TAE系統(tǒng)。如果OD260/OD280過低（<1.7），通?？梢酝ㄟ^減少組織和細胞的用量來實現(xiàn)。
5、什么時候需要加入RNA-Carrier?
答：樣品很少或樣品中RNA含量低，制備RNA時需要加入一定的 RNA載體，以提高RNA純化的得率。常用的載體有PolyAcryl Carrier, Poly A, Poly C和Glycogen。一定濃度范圍的 Carrier對一些RNA的下游應(yīng)用沒有影響，如RT-PCR, Northern Blot。
6、如何除去純化的RNA中微量的基因組DNA?
答：無論用種方式制備的總RNA,要絕對保證不含基因組DNA是不現(xiàn)實的。如果您希望得到DNA free 的RNA樣品，需要用RNase free的DNase I處理。
7、純化的RNA樣品如何保存？
答：如果希望得到最佳的結(jié)果，純化的RNA需要立即用于下游實驗。RNA可以保存在-80C冰箱，長期保存可以置于液氮中。如果沒有-80冰箱或液氮，RNA也可以保存在異丙醇或乙醇中，-20度保存。
8、組織和細胞樣品如何收集，保存？
答：組織樣品收集后，需要立即保存在液氮中，或在樣品中加入一定量的保護劑，有一些商業(yè)化的產(chǎn)品可以選用。一般實驗收集50-100mg組織就足夠了。
9、如何估計RNA的產(chǎn)量？
答：能計算出RNA的產(chǎn)量，通常都是有比較多的起材料，但是很多情況下能夠取得材料很少，所制備得到的RNA無法通過分光光度的方法測定含量和濃度。RNA的含量與組織和細胞的類型有比較大的關(guān)系, 同時與抽提的方式有關(guān)，例如用抽提小鼠組織100mg 肝可以得到500ug總RNA, 100mg肺 得到200ug總RNA，1百萬個細胞Hela細胞可以得到15ug左右的總RNA. mRNA的含量一般占總RNA含量的2-5%。根據(jù)這樣一些經(jīng)驗值，估算出您可能得到的量。樣品如果低于20mg或10000個細胞，在抽提時需要考慮加入合適的RNA沉淀載體。
10、RNA制備過程中那個環(huán)節(jié)要特別注意？
答：一般情況下，細胞和組織在RNA抽提液中都可以保存一段時間，因為幾乎所有的RNA的抽提裂解液中都含有高濃度的異硫氰酸胍等強變性劑，RNase基本是不起作用的，操作即使是粗放一些，也沒有多達關(guān)系。但是通常是離心后取上清，這時候RNA已沒有保護，操作要特別小心。
引物長度的選擇、純化方式及選擇與合成過程
引物越長，出現(xiàn)問題的概率就越大。有的公司合成過120base的引物，產(chǎn)率很低。除非需要，建議合成片段長度不要超過80mer，按照目前的引物合成效率，80mer的粗產(chǎn)品，全長（還不一定正確）引物的百分比不會超過40%，后續(xù)處理還有丟失很多，最后的產(chǎn)量很低。
長鏈引物出錯幾率非常高的原因是：引物合成時，每一步反應(yīng)效率都不能達到100%，產(chǎn)生堿基插入、缺失、置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。但是猶如PCR擴增，不可能絕對保證擴增產(chǎn)物中沒有突變，引物合成也不可能保證100%正確。要知道，引物合成中發(fā)生錯誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴增過程所產(chǎn)生的頻率都要高。做引物合成，長鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準備。
引物常用的純化方式脫鹽、BioRP / OPC純化、PAGE純化、HPLC純化。
◆ 脫鹽
寡核苷酸合成后，為了純化寡核苷酸成為天然的DNA結(jié)構(gòu)，首先必須去除保護基團。通過濃氨水處理，合成的寡核苷酸從固相載體上分離，2-氰乙氧基――磷酸二脂鍵的保護基團，以及堿基的保護基團基（苯甲酰基和異丁基）被去除，從而形成了天然的DNA結(jié)構(gòu)。然而，必要的去保護步驟完成后，寡核苷酸混合物還包含幾種必須被去除的小分子有機化合物。所有非必須有機化合物被移除的過程通常叫做脫鹽。脫鹽純化可以借助反向硅膠柱進行。盡管脫鹽純化可以移除所有的非必須有機雜質(zhì)，但它不能有效移除合成中產(chǎn)生微量的提前終止的寡核苷酸雜鏈。然而，脫鹽的寡核苷酸還是能夠滿足ＰＣＲ檢測等基礎(chǔ)生物研究。
◆ BioRP / OPC純化
如果寡核苷酸以“三苯甲基”的形式合成，則N-甲基寡核苷酸包含5’-DMT基團，提前終止的寡核苷酸不包含該基團。因為DMT基有強的親脂的特性，有5’-DMT基團的寡核苷酸與反相樹脂有親和性，因此反相親和樹脂通常被用于寡核苷酸的純化。利用反向樹脂和5’－DMT寡核苷酸存在強親和力，但是提前終止的寡核苷酸不包含DMT基團，所以，我們能夠成功的把想要的N-甲基寡核苷酸從提前終止的寡核苷酸雜質(zhì)中分離出來。
◆ HPLC
如果合成的寡核苷酸應(yīng)用于克隆，定向誘變或定量的基因探測，那么對其純度要求較高。脫鹽或OPC純化的寡核苷酸可能達不到要求，則HPLC純化被廣泛地用于這個目的。作為一種純化樹脂，陰離子交換樹脂或反向樹脂被用于寡核苷酸純化。陰離子交換樹脂的HPLC通常顯示95-98%純化效率，對于達到35-mer寡核苷酸的純化是充分的。反向樹脂化的HPLC與陰離子交換樹脂的HPLC呈現(xiàn)相似的純化效率。因為HPLC的純化效率很大程度依靠寡核苷酸的長度，用HPLC法不能有效純化長的寡核苷酸（大于35-mer)。
◆ PAGE
對于長的寡核苷酸的純化（50-100mer），我們推薦PAGE純化法，它使用交連的聚丙烯酰胺凝膠(電泳)作為純化基質(zhì)。盡管PAGE顯示出高的純化效率（＞98%），但它在額外的步驟方面有一些缺陷，比如在PAGE之后需要提取和脫鹽，繼而將導(dǎo)致純化產(chǎn)率的下降。
目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種，主要都是由ABI/PE 公司生產(chǎn)，而Bioneer自行研制的專利384并行高通量DNA合成儀，可實現(xiàn)99%的高合成率。無論采用什么機器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產(chǎn)率的高低，試劑消耗量的不同和單個循環(huán)用時的多少。
亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相鄰的核苷酸通過3′→5′磷酸二酯鍵連接。
第一步，將預(yù)先連接在固相載體CPG上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應(yīng)，脫去其5′-羥基的保護基團DMT，獲得游離的5′-羥基。
第二步，合成DNA的原料，亞磷酰胺保護核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3′端被活化，5′-羥基仍然被DMT保護，與溶液中游離的5′-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。
第三步，帶帽(capping)反應(yīng)，縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5′-羥基沒有參加反應(yīng)(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在純化時分離掉。
第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。
經(jīng)過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5′-羥基上的保護基團DMT，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。
通過氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來，通過OPC, PAGE等手段純化引物，成品引物用C18濃縮、脫鹽，沉淀。沉淀后的引物用水懸浮，測定OD260定量，根據(jù)定單要求分裝。
