學(xué)習(xí)中心
一、熒光定量化學(xué)原理介紹
1.TaqMan熒光探針
PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。如圖所示。
2.SYBR Green熒光染料
SYBR Green是一種DNA結(jié)合染料，能非特異地?fù)饺氲诫p鏈DNA中去。在游離狀態(tài)下，它不發(fā)出熒光，但一旦結(jié)合到雙鏈DNA中以后，便可以發(fā)出熒光。它的最大優(yōu)點就是可以與任意引物、模板相配合，用于任意反應(yīng)體系中。從經(jīng)濟角度考慮，它也比其它的探針的價格要便宜得多。但由于它能與所有的雙鏈DNA結(jié)合，所以一旦反應(yīng)體系中出現(xiàn)非特異擴增，那它就會影響到定量結(jié)果的可靠性與重復(fù)性。要避免這種不利因素，可以通過選擇良好的引物并優(yōu)化反應(yīng)條件以消除非特異性影響。
●熒光定量PCR中的一些術(shù)語
1. CT值：熒光信號有統(tǒng)計意義顯著增長(即穿過閾值線)時的循環(huán)次數(shù)，或者說是從基線到指數(shù)增長的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。
2. 閾值：閾值的默認(rèn)設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。
3.CT值與起始模板的量成線性關(guān)系，數(shù)學(xué)原理如圖所示：
二、主要實驗步驟如下：
1. 設(shè)計并合成Realtime PCR引物。
2. 引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶進(jìn)行含SG（SYBR® Green）的PCR反應(yīng)的優(yōu)化。
3. 客戶樣品RNA抽提
實驗對象為組織樣品，取適量（50-100mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），勻漿后抽提RNA。
實驗對象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA
4. RNA質(zhì)量檢測
a. 紫外吸收測定法測定RNA在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，以計算其濃度并評估RNA純度
b. 使用ambion公司的甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。
5. 使用逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega）進(jìn)行反應(yīng)，將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
6. 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品：
進(jìn)行相對定量，需要先將樣品的目的基因以及管家基因進(jìn)行PCR擴增，其產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7. 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測樣品分別加入到含SG的RealTime PCR反應(yīng)液中（其中TaqBeadTM熱啟動聚合酶來自Promega公司），進(jìn)行RealTime PCR擴增和檢測。
8. 檢測結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析：以對待測樣品的目的基因進(jìn)行定量。相對定量實驗需要進(jìn)一步用樣品的目的基因測得值除以管家基因測得值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的基因相對含量。
9. 提供實驗報告：包括詳細(xì)的實驗方法及實時熒光定量PCR實驗結(jié)果的相關(guān)圖表
三、樣本準(zhǔn)備
組織或細(xì)胞標(biāo)本
四 實時定量PCR全套技術(shù)服務(wù)收費標(biāo)準(zhǔn)
1.實驗步驟
1至9個標(biāo)本10個標(biāo)本以上
組織或細(xì)胞RNA抽提
RNA質(zhì)量檢測
cDNA制備 300元(一個組織或細(xì)胞標(biāo)本) 270元(一個組織或細(xì)胞標(biāo)本)
目的基因?qū)崟r定量PCR
看家基因?qū)崟r定量PCR
標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
數(shù)據(jù)分析 200元(一個標(biāo)本一個指標(biāo))
標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及看家基因內(nèi)參免費 180元(一個標(biāo)本一個指標(biāo))
標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及看家基因內(nèi)參免費
2.全套技術(shù)服務(wù)
您只需提供組織或細(xì)胞標(biāo)本，我們?yōu)槟瓿蒖NA抽提，cDNA制備，實時定量PCR，標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及數(shù)據(jù)分析的所有步驟。
標(biāo)本的運輸費用及引物合成費用客戶自理
如需制作PCR電泳效果圖，每張(1至9個標(biāo)本一張)收取100元
