一、MicroRNA原理介紹
MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)生的、長(zhǎng)度約20-24個(gè)核苷酸的小RNA,是發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成。其在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。每個(gè)miRNA可以有多個(gè)靶基因，而幾個(gè)miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過(guò)一個(gè)miRNA來(lái)調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可以通過(guò)幾個(gè)miRNAs的組合來(lái)精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。
MicroRNA形式
1. pre-miRNA
約70bp含microRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA。
制備方式：化學(xué)合成、生物轉(zhuǎn)錄合成、pre-miRNA質(zhì)粒表達(dá)載體、pre-miRNA病毒。
2. pri－miRNA
天然pri－miRNA
從染色體基因文庫(kù)中調(diào)取300bp－1000bp完整的microRNA基因，克隆到質(zhì)粒載體（普通載體或病毒載體），以強(qiáng)大的CMV啟動(dòng)子操縱該300bp－1000bp microRNA。
人工pri－miRNA
選擇一個(gè)完整的microRNA基因，克隆到質(zhì)粒載體（普通載體或病毒載體）。以人工合成的約70bp含miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的目標(biāo)pre-RNA替代原pre-RNA，并以pol Ⅱ/pol III 啟動(dòng)子操縱該microRNA結(jié)構(gòu)單元。
三. MicroRNA選擇
★pre-miRNA是最早采用的microRNA，擁有大量的成功報(bào)道?；瘜W(xué)合成的pre-miRNA制備快捷，可以標(biāo)記熒光等追蹤。缺點(diǎn)是制備的RNA穩(wěn)定性較差，而且，由于制備的microRNA較長(zhǎng)，合成時(shí)RNA的錯(cuò)誤難以避免（當(dāng)合成RNA超過(guò)60bp時(shí)，出現(xiàn)一個(gè)堿基錯(cuò)誤率約30％），轉(zhuǎn)錄制備的pre-miRNA穩(wěn)定性較好，但無(wú)flank結(jié)構(gòu)，很少使用。質(zhì)粒載體形式的pre－miRNA也因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)microRNA的flank對(duì)于microRNA功能和測(cè)定非常重要，現(xiàn)已逐漸被pri-miRNA取代。
★人工pri-miRNA效果較pre-miRNA好，也有足夠多的成功使用的經(jīng)驗(yàn)報(bào)道，但這種人工microRNA采用固定的mir155 flank，制備的microRNA功能不及天然原始microRNA，故也逐漸較少使用。
★原始天然pri-miRNA克隆自天然文庫(kù)的microRNA由于保留了每個(gè)microRNA獨(dú)自的原始天然雙臂結(jié)構(gòu)，效果更好，是近來(lái)被首選方法。
★pre-miRNA或pri-miRNA腺病毒：可以轉(zhuǎn)染大多數(shù)絕細(xì)胞，產(chǎn)品質(zhì)量可靠。缺點(diǎn)是腺病毒有一定的毒性，以往實(shí)驗(yàn)腺病毒毒性并未引起重視，但我們發(fā)現(xiàn)在microRNA實(shí)驗(yàn)中顯得比較突出。另外，制備周期長(zhǎng)，費(fèi)用高也是不容忽視的缺點(diǎn)。
★慢病毒microRNA：目前最好的microRNA實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品，缺點(diǎn)是慢病毒自身的不足，即制備lenti－virus時(shí)，病毒的質(zhì)量批間差異較大。
★AAV、或retrovirus microRNA：與腺病毒和lenti－virus microRNA一樣，具有病毒產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)與缺點(diǎn)。
四. MicroRNA產(chǎn)品
| 產(chǎn)品 | 制備方式 | 大小 | |
| Pri-microRNA | 天然Pri-microRNA庫(kù) 質(zhì)粒載體 病毒：腺病毒/慢病毒 |
300－1000 bp | |
| 人工Pri-microRNA庫(kù)/訂制 質(zhì)粒載體 病毒：腺病毒/慢病毒 |
約500 bp | ||
| Pre-microRNA | 合成 化學(xué)合成或生物轉(zhuǎn)錄 |
約70bp | |
| 載體 質(zhì)粒載體 病毒：腺病毒/慢病毒 |
|||
1. pri－miRNA庫(kù)
★所有的pri-miRNA都是從人類基因組DNA中擴(kuò)增出來(lái)的，其長(zhǎng)度大約為300bp－1000bp。
★microRNA完全忠實(shí)于細(xì)胞內(nèi)的天然結(jié)構(gòu),具有更高的效率。
★microRNA表達(dá)質(zhì)粒載體，可以直接使用。microRNA轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)單元已經(jīng)構(gòu)建到基于FIV的慢病毒載體，同時(shí)與晶賽公司的腺病毒系統(tǒng)完全兼容，方便制備病毒。
★EGFP和miRNA在CMV啟動(dòng)子的引導(dǎo)下共表達(dá)。
★microRNA質(zhì)粒經(jīng)過(guò)嚴(yán)格測(cè)序。
★部分制備的microRNA質(zhì)?；虿《窘?jīng)過(guò)生物學(xué)測(cè)定，microRNA效果肯定與明確。
★已經(jīng)完成microRNA列表(部分)，請(qǐng)Email咨詢查找其它的miRNA。
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miRNA名稱 |
測(cè)序結(jié)果 |
miRNA大小 |
載體 |
生物學(xué)測(cè)定 |
|
1 |
hsa-mir-98 |
ok |
562 |
B |
Ok |
|
2 |
hsa-mir-96 |
ok |
511 |
B |
Ok |
|
3 |
hsa-mir-95 |
ok |
495 |
B |
Ok |
|
4 |
hsa-mir-17-92 |
ok |
978 |
L |
Ok |
|
…… |
…… |
…… |
…… |
…… |
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|
513 |
hsa-mir-18a |
序列錯(cuò)誤 |
681 |
L |
Ok |
|
514 |
hsa-mir-345 |
一個(gè)突變 |
548 |
L |
Ok |
|
515 |
hsa-mir-589 |
Ok |
620 |
L |
Ok |
|
516 |
hsa-mir-219-2 |
Ok |
610 |
L |
|
|
517 |
hsa-mir-215 |
ok |
458 |
L |
Ok |
|
518 |
hsa-mir-212 |
一個(gè)突變 |
474 |
L |
Ok |
|
...繼續(xù)中 |
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B：同時(shí)有質(zhì)粒、慢病毒質(zhì)粒載體和腺病毒質(zhì)粒載體；
L：僅有慢病毒載體。可根據(jù)要求改構(gòu)到您希望的載體。
更多及詳細(xì)microRNA情報(bào)請(qǐng)通過(guò)Email：tech@bluegene.cc咨詢。
更多新發(fā)現(xiàn)的microRNA請(qǐng)參見(jiàn)MiRBase：http://microrna.sanger.ac.uk/
2. pri－miRNA或pre－miRNA載體/載體構(gòu)建服務(wù)
★BG有256個(gè)構(gòu)建好的pre－miRNA。
★pre-microRNA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
?、賛icroRNA轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)單元通過(guò)增強(qiáng)型Pol III 啟動(dòng)子（hU6, hH1, h7SK, mU6）引導(dǎo)pre-miRNA的過(guò)表達(dá)。
?、诳蛇x擇帶EGFP熒光標(biāo)簽。
?、劢K產(chǎn)品均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格測(cè)序。
?、茌d體類型：和siRNA一樣，microRNA的效率只與“啟動(dòng)子－miRNA－終止信號(hào)”轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)單元有關(guān)，因此任何質(zhì)粒microRNA作用效果應(yīng)該基本一致，質(zhì)粒小一些對(duì)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率略有好處。晶賽公司的microRNA質(zhì)粒與腺病毒、慢病毒系統(tǒng)完全兼容，許多表達(dá)載體已包裝成腺病毒及慢病毒，有數(shù)十種載體可供選擇，請(qǐng)Email咨詢載體情報(bào)。這種pre－microRNA存在不足，請(qǐng)參考MicroRNA簡(jiǎn)介中有關(guān)部分。
★pri－microRNA表達(dá)質(zhì)粒
①pre-microRNA＋mir155的microRNA兩臂共同組成pri-microRNA。
質(zhì)粒可用于直接制備基于FIV的慢病毒，并同時(shí)與晶賽公司的腺病毒系統(tǒng)完全兼容。
?、贓GFP和miRNA在CMV啟動(dòng)子的引導(dǎo)下共表達(dá)。
?、劢K產(chǎn)品均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格測(cè)序。
?、茌d體類型：和siRNA一樣，microRNA的效率只與“啟動(dòng)子－miRNA－終止信號(hào)”轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)單元有關(guān)，因此任何質(zhì)粒microRNA作用效果應(yīng)該基本一致，質(zhì)粒小一些對(duì)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率略有好處。晶賽公司的microRNA質(zhì)粒與腺病毒、慢病毒系統(tǒng)完全兼容，許多表達(dá)載體已包裝成腺病毒及慢病毒，有數(shù)十種載體可供選擇，請(qǐng)Email咨詢載體情報(bào)。這種pre－microRNA存在不足，請(qǐng)參考MicroRNA簡(jiǎn)介中有關(guān)部分。
3. 生物轉(zhuǎn)錄合成microRNA
產(chǎn)品形式為70bp左右的pre-microRNA。
生物合成的microRNA有較之化學(xué)合成的microRNA有更高的穩(wěn)定性及效率。以晶賽專利的高保真RNA生物合成技術(shù)為基礎(chǔ)的microRNA產(chǎn)品有著迄今最好的正確率，從而確保您實(shí)驗(yàn)的成功。這種pre－microRNA存在不足，請(qǐng)參考MicroRNA簡(jiǎn)介中有關(guān)部分。
4. 化學(xué)合成的microRNA
產(chǎn)品形式為70bp左右的pre-microRNA。
化學(xué)合成非?？旖荩ㄙ?gòu)一周后就可以開(kāi)始您的實(shí)驗(yàn)。這種pre－microRNA存在不足，請(qǐng)參考MicroRNA簡(jiǎn)介中有關(guān)部分。
5. MicroRNA病毒載體
腺病毒MicroRNA
全部MicroRNA產(chǎn)品均能夠以腺病毒形式提供。
慢病毒MicroRNA
提供慢病毒MicroRNA質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染試劑、包裝細(xì)胞，操作方法。您可以方便地自己制備慢病毒。
五. 服務(wù)價(jià)格
天然pri－microRNA：2900元/50 ug microRNA，包括質(zhì)粒對(duì)照。
Pre－microRNA載體構(gòu)建：1900元/50 ug microRNA，包括質(zhì)粒對(duì)照。
其它形式的microRNA，請(qǐng)咨詢。
