一、RNAi技術原理
RNA干擾（RNA interference，RNAi）現(xiàn)象是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA (dsRNA) 介導細胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，導致靶基因的表達沉默，產(chǎn)生相應的功能表型缺失。這一現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默機制 (Posttranscriptional gene silencing，PTGS)。短片段的雙鏈RNA在體內(nèi)能在酶（Dicer）及相關復合物（RISC）的作用下，變成單鏈分子，并與目標基因mRNA互補，在Dicer酶作用下，使mRNA發(fā)生剪切，轉(zhuǎn)錄受抑制或翻譯受到抑制，從而在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平干擾基因表達。
研究表明，RNAi可能的作用途徑大致可分為兩種：一種是以線蟲、真菌和植物為代表的RdRp（RNA-dependent RNA polymerase）途徑。RNAi現(xiàn)象有一個靶RNA的大量產(chǎn)生過程，產(chǎn)生的靶RNA在Dicer的進一步作用下， 產(chǎn)生大量的siRNA，達到有效濃度的siRNA能夠啟動RNAi機制，降解靶mRNA；另一種途徑以果蠅和哺乳動物細胞為代表，外源或內(nèi)源的雙鏈RNA在Dicer的切割下生成siRNA，這些siRNA與其他蛋白質(zhì)形成RISC(RNA-induced silencing complex）結(jié)構(gòu)，能夠識別切割靶mRNA分子。RNAi現(xiàn)象除了使生物體擁有抗病毒、穩(wěn)定轉(zhuǎn)座子和參與胚胎發(fā)育的生物學功能外，還可作為未知功能基因的逆向遺傳學的研究手段。目前，RNAi已成為哺乳動物基因功能研究的重要方法。
二、RNAi實驗流程
● 設計siRNA
● 合成siRNA
● 將siRNA導入細胞
● 監(jiān)測RNAi效果
反義寡核苷酸技術
DNA上攜帶有編碼蛋白質(zhì)的氨基酸信息的核酸序列的鏈，稱為正義鏈(senses trand)；另一條鏈的核苷酸序列與正義鏈互補，稱為反義鏈(antisensestrand)。所謂反義寡核苷酸(antisense oligo-deoxyribonucleotide，AS-ODN)又稱“反義核酸”，即為人工合成長度為10-30個堿基的DNA分子及其類似物，通過Watson-Crick堿基配對，與靶基因mRNA(正義鏈)上的特定序列雜交，從而抑制蛋白質(zhì)的表達。
反義寡核苷酸包括反義DNA、反義RNA和酶性RNA。作用原理是：①AS-ODNs與DNA結(jié)合，抑制DNA復制和轉(zhuǎn)錄；②AS-ODNs與mRNA前體結(jié)合，阻斷RNA加工、成熟，影響核糖體沿mRNA移動；③激活RNase剪切雜交鏈中未配對的堿基。
反義寡核苷酸技術具有明顯的優(yōu)點：
（1）反義核酸是針對特定的靶mRNA（DNA）的序列，基因序列已知；
（2）反義核酸僅有15-30個堿基，結(jié)構(gòu)簡單，容易設計和體外大量合成。
（3）反義核酸進入細胞內(nèi)與細胞周期無關，既可進入增殖期細胞又可進入非增殖期細胞。
反義寡核苷酸技術主要應用于基因的功能研究，以及臨床的基因治療。
三、樣本準備
源基因樣本
四、BG為您提供以下服務
● 設計并合成干擾siRNA序列，設計并合成正義及反義寡核苷酸序列；
● 獲得siRNA核酸或構(gòu)建siRNA表達載體；
● 根據(jù)您的要求進一步轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞；
● 檢測抑制效果:熒光定量PCR檢測mRNA表達情況、Western Blot、IHC檢測蛋白表達情況。
● 提供實驗報告：siRNA序列、反義寡核苷酸序列、構(gòu)建載體的測序報告；熒光定量PCR檢測報告、Western Blot及IHC圖片等。
◆ 特別說明
我們盡量優(yōu)化選擇靶位點，由于并不是每個siRNA都能有效抑制目的基因表達，一般建議您設計三個或三個以上序列。
本試驗收費情況請電話垂詢。
