反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse transcriptase PCR,RT-PCR）是一種從RNA擴(kuò)增cDNA拷貝的方法。RT-PCR對(duì)于獲得與克隆mRNA的5’、3’末端序列和從非常少量的mRNA樣品構(gòu)建大容量的cDNA文庫(kù)方面都是極為靈敏與通用的方法。此外，RT-PCR還易于鑒定已轉(zhuǎn)錄序列是否發(fā)生突變及呈現(xiàn)多態(tài)性，還可用于測(cè)定基因表達(dá)的強(qiáng)度。我公司采用二步RT-PCR法，可滿(mǎn)足客戶(hù)不同的實(shí)驗(yàn)要求。
二、操作流程
● 模板制備：見(jiàn)RNA提取技術(shù)服務(wù)。
● 引物設(shè)計(jì)
客戶(hù)提供上、下游引物，或者我公司提供免費(fèi)的引物設(shè)計(jì)及合成（包括RT-PCR半定量檢測(cè)中的內(nèi)參引物）。
● 反轉(zhuǎn)錄
（1）Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量<15 μl。
試劑名稱(chēng) 使用量
模板RNA 2μg
Oligo(dT)12-18 Primer（50μM） 2.5μl
（2）70℃保溫5分鐘后迅速在冰上急冷2分鐘以上。
（3）離心數(shù)秒鐘使模板RNA/引物的變性溶液聚集于Microtube管底部。
（4）在上述Microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。
試劑名稱(chēng) 使用量
上述模板RNA/引物變性溶液
5×M-MLV Buffer 5μl
dNTP Mixture（各10 mM） 1.25μl
RNase Inhibitor（40 U/μl ） 25U
M-MLV（200 U/μl ） 200U
RNase free dH2O up to 25μl
42℃保溫1小時(shí)。
（5）70℃保溫15分鐘后冰上冷卻，得到cDNA溶液。
若需要表達(dá)，參考基因表達(dá)服務(wù)。若需要進(jìn)行RT-PCR半定量分析，接著以下的操作。
● RT-PCR半定量分析
PCR擴(kuò)增目的基因及看家基因，產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行灰度掃描分析。
三、樣本準(zhǔn)備
提供的樣品要新鮮并盡可能多，不推薦提供RNA樣品，或者提供cDNA，并盡可能詳細(xì)的提供背景資料（基因序列、Genebank accession number擴(kuò)增產(chǎn)物的用途等）。
四、價(jià)格.實(shí)驗(yàn)周期
樣本數(shù) 收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn) 實(shí)驗(yàn)周期
8個(gè)以下（含8個(gè)） 120元/樣品 8個(gè)工作日
50個(gè)以下（含50個(gè)） 100元/樣品 15個(gè)工作日
50個(gè)以上 詢(xún)價(jià) 20個(gè)工作日
RNA模板的制備需另收費(fèi)（見(jiàn)RNA提取服務(wù)）以上為1個(gè)目的基因的報(bào)價(jià)。進(jìn)行相對(duì)定量分析時(shí)，同一材料的多個(gè)目的基因的價(jià)格=1個(gè)目的基因價(jià)格×目的基因個(gè)數(shù)。
提供結(jié)果
完整的實(shí)驗(yàn)操作步驟、電泳圖、定量分析結(jié)果等。
