一、結(jié)構(gòu)
線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)的雙層膜細(xì)胞器，一般呈短棒狀或圓球狀，直徑在0.5到10微米左右（因生物種類和生理狀態(tài)而異）。線粒體由外至內(nèi)可劃分為外膜、膜間隙、內(nèi)膜和基質(zhì)四個(gè)功能區(qū)。外膜比較光滑，內(nèi)膜則向內(nèi)褶皺形成線粒體嵴。嵴形狀是判斷線粒體的重要形態(tài)學(xué)指標(biāo)。
二、功能
線粒體是真核生物進(jìn)行氧化代謝的部位，是糖類、脂肪和氨基酸等進(jìn)行三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化的場(chǎng)所，產(chǎn)生的 ATP是生物重要的能量來(lái)源。因此，線粒體是細(xì)胞產(chǎn)生生物能量，進(jìn)行有氧呼吸的主要場(chǎng)所，被稱之為細(xì)胞的“能量工廠。線粒體還可以儲(chǔ)存鈣離子，可以和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞外基質(zhì)等結(jié)構(gòu)協(xié)同作用，從而控制細(xì)胞中的鈣離子濃度的動(dòng)態(tài)平衡。
線粒體具有獨(dú)立的DNA。與細(xì)胞核DNA不同，線粒體DNA屬于母系遺傳。與線粒體異常相關(guān)的疾病，是一大類遺傳代謝病。其臨床表現(xiàn)復(fù)雜，臨床上確診比較困難，往往需要通過(guò)大分子酶學(xué)活性檢測(cè)分析并結(jié)合遺傳學(xué)基因分析的雙重手段確定病因。
線粒體作為生物能代謝的主要細(xì)胞器，對(duì)各種異常代謝和細(xì)胞損傷最為敏感。最常見(jiàn)的病理改變可以概括為線粒體氧化磷酸化異常以及線粒體數(shù)量、大小和結(jié)構(gòu)的改變。此外，線粒體的損傷和衰老與保健也有著密切的關(guān)聯(lián)。如果能夠保持線粒體的完好無(wú)損就可以保持細(xì)胞的活力，就能夠有更強(qiáng)的新陳代謝，也能夠抵抗衰老。有關(guān)線粒體內(nèi)外膜活性，電子傳遞鏈功能以及線粒體DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成等實(shí)驗(yàn)研究一直是生物醫(yī)學(xué)研究的重要內(nèi)容。而線粒體的完整性對(duì)于實(shí)驗(yàn)研究的可靠性有著決定性的影響。因此分離提取到較好的線粒體是實(shí)驗(yàn)中最為關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)。
一、樣本收集
1、收集細(xì)胞：
對(duì)于貼壁細(xì)胞：吸棄培養(yǎng)基，PBS洗一遍，用胰酶消化細(xì)胞，37℃ 5分鐘。1000rpm室溫離心5分鐘，收集細(xì)胞。
對(duì)于懸浮細(xì)胞：1000rpm室溫離心5分鐘，收集細(xì)胞。
2、洗滌細(xì)胞：用預(yù)冷的PBS輕輕重懸細(xì)胞沉淀，1000rpm室溫離心5分鐘，棄上清。重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。
二、操作步驟
1、準(zhǔn)備溶液：
根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，取適量試劑A，按比例加入試劑D（100×），混勻即可，配置成AD混合液。
2、預(yù)處理：按每2000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，加入0.3-0.5ml預(yù)冷的AD混合液，輕輕懸浮細(xì)胞，放置于冰上5分鐘。（注：小體積研磨破碎效率高于大體積）
3、研磨：
破碎細(xì)胞過(guò)程如下：使用研磨器研磨大約30-45次，并進(jìn)行勻漿效果鑒定實(shí)驗(yàn)（不同細(xì)胞不同勻漿器所需的勻漿次數(shù)有所不同）。
通常建議研磨途中取10ul細(xì)胞勻漿液，加入10ul臺(tái)盼藍(lán)染色液，混勻后顯微鏡下觀察臺(tái)盼藍(lán)染色陽(yáng)性（藍(lán)色）細(xì)胞的比例。如果陽(yáng)性細(xì)胞比例不足50%，即可增加10次勻漿，隨后進(jìn)行相同的檢測(cè)操作。當(dāng)陽(yáng)性比例超過(guò)50%時(shí)即可進(jìn)行下一步，切勿過(guò)度研磨，否則會(huì)導(dǎo)致線粒體的損傷。
4、用AD混合液沖洗研磨器壁，連同研磨后的勻漿液轉(zhuǎn)移至5ml 離心管中，4℃，1000g離心10分鐘，將獲得的上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，4℃，10000g離心10分鐘，沉淀即為粗提線粒體。
5、向粗提線粒體中加入1ml 試劑E5，輕輕吹打使線粒體懸浮。
在超速離心管中由下向上按如下順序添加不連續(xù)密度梯度介質(zhì)：0.5ml 試劑E1，1ml 試劑E2，1ml 試劑E3，1ml 試劑E4，1ml含有線粒體的試劑E5。鋪層完畢，4℃，52000g 離心90分鐘。
6、離心完畢，小心用槍吸取位于E3和E4分層的物質(zhì)（具體情況可能需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整），將溶液收集到普通EP管中，加入三倍體積的試劑A混勻后，4℃，10000g離心10分鐘，收集沉淀。
7、將沉淀用試劑C洗滌一次，4℃，10000g離心10分鐘，沉淀即為純化后結(jié)構(gòu)完整的線粒體。
8、線粒體的處理：
客戶可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需要將純化后的線粒體產(chǎn)品進(jìn)行以下處理
A：加入100-250ul試劑C重懸線粒體，得到線粒體懸液，進(jìn)行線粒體活性相關(guān)的檢測(cè)。
B：向線粒體沉淀中加入200-500ul 試劑B（含試劑D），冰上裂解0.5小時(shí)。最后4℃，12000g離心10分鐘，上清即為線粒體蛋白樣品。
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