一、結構
線粒體是真核細胞內(nèi)的雙層膜細胞器，一般呈短棒狀或圓球狀，直徑在0.5到10微米左右（因生物種類和生理狀態(tài)而異）。線粒體由外至內(nèi)可劃分為外膜、膜間隙、內(nèi)膜和基質(zhì)四個功能區(qū)。外膜比較光滑，內(nèi)膜則向內(nèi)褶皺形成線粒體嵴。嵴形狀是判斷線粒體的重要形態(tài)學指標。
二、功能
線粒體是真核生物進行氧化代謝的部位，是糖類、脂肪和氨基酸等進行三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化的場所，產(chǎn)生的 ATP是生物重要的能量來源。因此，線粒體是細胞產(chǎn)生生物能量，進行有氧呼吸的主要場所，被稱之為細胞的“能量工廠。線粒體還可以儲存鈣離子，可以和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞外基質(zhì)等結構協(xié)同作用，從而控制細胞中的鈣離子濃度的動態(tài)平衡。
線粒體具有獨立的DNA。與細胞核DNA不同，線粒體DNA屬于母系遺傳。與線粒體異常相關的疾病，是一大類遺傳代謝病。其臨床表現(xiàn)復雜，臨床上確診比較困難，往往需要通過大分子酶學活性檢測分析并結合遺傳學基因分析的雙重手段確定病因。
線粒體作為生物能代謝的主要細胞器，對各種異常代謝和細胞損傷最為敏感。最常見的病理改變可以概括為線粒體氧化磷酸化異常以及線粒體數(shù)量、大小和結構的改變。此外，線粒體的損傷和衰老與保健也有著密切的關聯(lián)。如果能夠保持線粒體的完好無損就可以保持細胞的活力，就能夠有更強的新陳代謝，也能夠抵抗衰老。有關線粒體內(nèi)外膜活性，電子傳遞鏈功能以及線粒體DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成等實驗研究一直是生物醫(yī)學研究的重要內(nèi)容。而線粒體的完整性對于實驗研究的可靠性有著決定性的影響。因此分離提取到較好的線粒體是實驗中最為關鍵的一個環(huán)節(jié)。
一、樣本收集
1、收集細胞：
對于貼壁細胞：吸棄培養(yǎng)基，PBS洗一遍，用胰酶消化細胞，37℃ 5分鐘。1000rpm室溫離心5分鐘，收集細胞。
對于懸浮細胞：1000rpm室溫離心5分鐘，收集細胞。
2、洗滌細胞：用預冷的PBS輕輕重懸細胞沉淀，1000rpm室溫離心5分鐘，棄上清。重懸細胞并計數(shù)。
二、操作步驟
1、準備溶液：根據(jù)實驗需要，取適量試劑A，按比例加入試劑D（100×），混勻即可，配置成AD混合液。
2、預處理：按每2000萬個細胞，加入0.3-0.5ml預冷的AD混合液，輕輕懸浮細胞，放置于冰上5分鐘。（注：小體積研磨破碎效率高于大體積）
3、研磨：破碎細胞過程如下：使用研磨器研磨大約30-45次，并進行勻漿效果鑒定實驗（不同細胞不同勻漿器所需的勻漿次數(shù)有所不同）。
通常建議研磨途中取10ul細胞勻漿液，加入10ul臺盼藍染色液，混勻后顯微鏡下觀察臺盼藍染色陽性（藍色）細胞的比例。如果陽性細胞比例不足50%，即可增加10次勻漿，隨后進行相同的檢測操作。當陽性比例超過50%時即可進行下一步，切勿過度研磨，否則會導致線粒體的損傷。
4、用AD混合液沖洗研磨器壁，連同研磨后的勻漿液轉移至5ml離心管中，4℃，1000g離心10分鐘，將獲得的上清轉移至另一離心管中，4℃，10000g離心10分鐘。
5、將沉淀用試劑C洗滌一次，4℃，10000g離心10分鐘，沉淀即為純化后結構完整的線粒體。
6、線粒體的處理：客戶可以根據(jù)自己的實驗需要將純化后的線粒體產(chǎn)品進行以下處理
A：加入100-250ul試劑C重懸線粒體，得到線粒體懸液，進行線粒體活性相關的檢測。
B：向線粒體沉淀中加入200-500ul 試劑B（含試劑D），冰上裂解0.5小時。最后4℃，12000g離心10分鐘，上清即為線粒體蛋白樣品。
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