研究背景
當(dāng)前生物制藥管線，針對炎癥、癌癥和感染性病的治療的主要藥物形式是單抗藥物。主要抗體藥物靶點有TNFα，VEGF/VEGFR，PD-1/PD-L1，HER2，IL12/IL23，IL17/IL17R等等。2019年市場規(guī)約1400億美元，而且逐年遞增。
抗體藥物由最初的鼠源抗體，到人鼠嵌合抗體，再到人源化和全人源化抗體發(fā)展，并衍生了Fab抗體、單域和單鏈等抗體形式。如今單抗也衍生出了創(chuàng)新型抗體藥物如小分子抗體，抗體偶聯(lián)藥物，抗體融合蛋白，雙特異性和多特異性抗體[1]。
常見的蛋白藥物表達(dá)系統(tǒng)，有原核表達(dá)系統(tǒng)，如Escherichia coli ，E.coli；植物表達(dá)系統(tǒng)；真菌表達(dá)系統(tǒng)，如畢赤酵母，釀酒酵母；昆蟲表達(dá)系統(tǒng)，如Spodoptera frugiperda cells，SF9昆蟲細(xì)胞；哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary cells, CHO)，非洲綠猴腎細(xì)胞（African green monkey kidney cells，Vero）等。其中哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，在臨床藥物的生產(chǎn)中，使用較為廣泛。后續(xù)我們介紹了常見蛋白表達(dá)系統(tǒng)及其品系特點，蛋白純化所用填料介質(zhì)及其應(yīng)用范圍，以及蛋白純化過程中需要重點關(guān)注的雜質(zhì)殘留，及其致病性或降低蛋白活性和穩(wěn)定性的成分（含雜質(zhì)殘留檢測方法的研究進(jìn)展）。
以CHO為例，CHO細(xì)胞產(chǎn)生的HCP，種類多樣，復(fù)雜[2]。倉鼠與人類有80%共同基因，CHO HCP和人內(nèi)源蛋白有同源性，殘留的HCP也會導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)，并引起與人自身蛋白的交叉反應(yīng)[3,4]。
法規(guī)要求
在抗體藥物表達(dá)后，隨即進(jìn)行培養(yǎng)上清收集等下游純化操作。而下游操作的設(shè)計主要是宿主細(xì)胞總蛋白（Host cell protein, HCP）、核酸（質(zhì)粒，宿主基因組，RNA），脂質(zhì)，和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)[5]。最終產(chǎn)品的HCP水平<100ppm，殘留DNA<10ng/劑，和<5%的高分子量的免疫總量[6]。
宿主細(xì)胞總蛋白介紹
宿主細(xì)胞總蛋白：對HCP的分析中，根據(jù)產(chǎn)物中HCP的作用，可以將之分為4類[121]：
1）具有高生物活性的蛋白。其中的雜質(zhì)，如CHO-K1分泌的轉(zhuǎn)化生長因子β1對多類型細(xì)胞，都有很強(qiáng)的多重效應(yīng)，并對人體細(xì)胞有誘導(dǎo)免疫的活性[7]。
2）對產(chǎn)物蛋白或產(chǎn)物保護(hù)劑有分解作用的酶類。在大分子配方中，改善蛋白在生產(chǎn)，運輸和儲存中的穩(wěn)定性[8]。如吐溫80受到磷脂酶切割分子脂鍵，分解成脂肪酸和醇，導(dǎo)致藥物保護(hù)活力喪失。
3）對宿主有較強(qiáng)免疫原性的蛋白，具備佐劑效應(yīng)，并會誘導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)。誘導(dǎo)釋放的細(xì)胞因子，并導(dǎo)致抗原呈遞過程相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)志物的上調(diào)。
4）對機(jī)體或產(chǎn)物蛋白無作用，但是和產(chǎn)物蛋白能夠共結(jié)合并純化下來的一類蛋白。
HCP檢測的經(jīng)典方法介紹
經(jīng)典的HCP檢測方法有雙向電泳，蛋白質(zhì)譜和酶聯(lián)免疫吸附試驗。且FDA規(guī)定，該三種方法要相互驗證，以期能獲得準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。
同時也有創(chuàng)新的方法引入，如液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS)和Immunoassay platform ELLA和Electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA)等方法。
目前，ELISA實驗依賴于其優(yōu)異的特異性，靈敏度和高通量，仍是HCP檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。同時結(jié)合LC-MS與2D方法結(jié)合驗證。
賽唐生物基于ELISA方法，專注HCP產(chǎn)品領(lǐng)域研發(fā)10年，踏實做技術(shù)開發(fā)與制造。可以提供以下全流程專屬性技術(shù)服務(wù)。
免疫與抗體制備
動物免疫是蛋白抗原，借助包裹抗原溶液的免疫佐劑，將抗原遞送到皮下，經(jīng)過T help細(xì)胞將抗原呈遞給B細(xì)胞，并形成漿細(xì)胞，分泌特異性抗體到血液中。將HCP蛋白抗原與佐劑充分混合，皮下免疫年輕雌性兔，五次免疫，各間隔兩周后，酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清效價，做加強(qiáng)免疫或動脈采血宰殺收集血清抗體。免疫后抗體效價可以達(dá)到106-107水平?？寡辶靠蛇_(dá)數(shù)十至數(shù)百毫升。
純化與抗體標(biāo)記
動脈采血，4℃ 過夜后，離心取上清，即為抗血清。經(jīng)過鹽析，Protein A/G親和層析，非IgG類蛋白流穿，IgG通過Fc端結(jié)合到Protein A結(jié)構(gòu)域上，過量的結(jié)合緩沖液，平衡后低pH洗脫，有尖銳UV洗脫峰。收集洗脫液，并平衡至中性pH。 經(jīng)過緩沖液置換，濃縮，Nanodrop One C UV以及Bradford法定量，并標(biāo)記生物素或者辣根過氧化物酶，用于HCP的結(jié)合驗證實驗。
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試劑盒QC
標(biāo)準(zhǔn)曲線
LOD/LOQ
回收率
穩(wěn)定性
加速破壞實驗顯示，試劑盒4℃可儲存一年。保質(zhì)期可6個月。
樣本檢測
使用藥物產(chǎn)物樣本，和細(xì)胞上清樣本，顯示藥物產(chǎn)物基本優(yōu)于進(jìn)口品牌，細(xì)胞培養(yǎng)上清優(yōu)于進(jìn)口品牌。(注：鑒于細(xì)胞培養(yǎng)上清是賽唐生物提供，可以做第三方進(jìn)一步對比。)
參考文獻(xiàn)：
[1] Chadd HE, Chamow SM. Therapeutic antibody expression technology[J]. Current Opinion In Biotechnology, 2001, 12(2): 188-194.
[2] Smales C M, Dinnis D M, Stansfield S M, et al. Comparative proteomic analysis of GS-NS0 murine myeloma cell lines with varying recombinant monoclonal antibody production rate[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2004, 88(4):474-488.
[3] Gutiérrez AH, Moise L, De Groot AS. Of [hamsters] and men: A new perspective on host cell proteins[J]. Human Vaccines & Immunotherapeutics, 2012, 8(9):1172-1174
[4] Kanade Shinkai, Markus Mohrs & Richard M. Locksley. Helper T cells regulate type-2 innate immunity in vivo[J]. Nature, 2002, 420:825-829.
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上海賽唐生物技術(shù)有限公司（賽唐生物）成立于2017年8月，由藍(lán)基生物投資的全資子公司，是一家專注于生命科學(xué)領(lǐng)域中蛋白藥物檢測和蛋白組庫系列產(chǎn)品開發(fā)的高科技公司，擁有關(guān)鍵的核心技術(shù)以及高級的人才儲備。 坐落于上海產(chǎn)業(yè)集群地---張江國際醫(yī)學(xué)園區(qū)張江基因島6號樓，自成立之初專注于生命科學(xué)領(lǐng)域中蛋白藥物檢測、生物制品質(zhì)量控制檢測和蛋白組庫系列產(chǎn)品的開發(fā)，是集研發(fā)、生產(chǎn)、銷售和技術(shù)服務(wù)為一體的高科技企業(yè)。
公司在七年的發(fā)展過程中陸續(xù)通過了ISO9001、ISO13485質(zhì)量管理體系認(rèn)證、上海市“專精特新”中小企業(yè)認(rèn)定以及國家級科技型中小企業(yè)認(rèn)證，目前可提供宿主細(xì)胞蛋白(HCP)殘留檢測試劑盒、宿主細(xì)胞DNA(HCD)殘留檢測試劑盒、樣本前處理DNA抽提試劑盒、細(xì)胞組分抽提試劑盒、科研檢測ELISA試劑盒、重組蛋白、體外診斷等系列產(chǎn)品以及蛋白組學(xué)分析、生物制藥工業(yè)檢測產(chǎn)品定制化等各類CRO技術(shù)服務(wù)。
賽唐生物是由海歸科學(xué)家與業(yè)內(nèi)資深教授專家為首并組建的一支穩(wěn)定且擁有關(guān)鍵的核心技術(shù)的科研隊伍，擁有蛋白庫/cDNA庫產(chǎn)品制備和驗證、重組蛋白生產(chǎn)制備和鑒定技術(shù)、體外診斷檢測試劑等多個研發(fā)平臺，為生命科學(xué)和生物制藥的藥物設(shè)計、藥物篩選、藥物生產(chǎn)以及藥物質(zhì)量驗證提供全方位的服務(wù)。致力于成為獨立商業(yè)運作的擁有自主知識產(chǎn)權(quán)以及核心技術(shù)、核心產(chǎn)品、核心技術(shù)服務(wù)的-全球?qū)I(yè)的蛋白研究中心。堅持以專業(yè)的技術(shù)、專業(yè)的服務(wù)、專業(yè)的產(chǎn)品為理念服務(wù)于客戶，為生命健康領(lǐng)域持續(xù)輸出具有核心競爭力的產(chǎn)品和服務(wù)為目標(biāo)，從而為人類健康貢獻(xiàn)力量。
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